一种抗革兰氏阳性致病菌新型靶酶——分选酶

许多革兰氏阳性菌的表面蛋白是经过一种被称为分选酶的半胱氨酸转肽酶的作用而锚定到细胞壁上,由于表面蛋白在病原菌的致病性方面起关键作用,分选酶有可能成为降低革兰氏阳性菌致病性的药物靶点.目前,通过对金黄色葡萄球菌中分选酶A(SrtA)的研究,已初步阐明分选酶的作用机制及其活性位点,与此同时,一些SrtA抑制剂的初步鉴定为今后抑制剂更深层次的筛选提供了基础.

不同pH对嗜酸乳杆菌分选酶相关基因表达及菌体黏附能力的影响

摘要：为探究嗜酸乳杆菌在小肠中黏附调控机制，嗜酸乳杆菌黏附与细胞壁分选酶及其相关蛋白的基因表达之间的关系。实验构建体外模型研究了不同pH培养条件下嗜酸乳杆菌的黏附能力、测定了分选酶基因和分选酶相关蛋白基因相对表达差异。实验结果表明：在pH5．5-7．5培养条件下，随着pH升高嗜酸乳杆菌菌体黏附性显著增加，srt基因及其相关蛋白的基因表达量显著上调。研究结果为pH对嗜酸乳杆菌的黏附效应的影响机制提供了相关理论依据。

分选酶A(SrtA)的GST融合表达、纯化及活性测定

构建GST/金黄色葡萄球菌分选酶A(SrtA)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化分选酶,并利用展示在酵母表面的底物检测分选酶的活性。以pMD20-SrtA为模板,PCR扩增得到SrtA△N59基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-SrtA△N59,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,GST亲和层析分离纯化得到SrtA△N59,与展示在酵母表面的底物序列QALPETGEE-linker-EGFP作用,产生游离的EGFP,通过酶标仪检测EGFP荧光强度确定分选酶的活性。结果显示,重组表达载体pGEX-SrtA△N59经IPTG诱导,表达出相对分子质量约为42 kD的融合蛋白,SDS-PAGE分析,该融合蛋白是以可溶形式表达。分离纯化得到的分选酶与底物作用,其荧光强度由568.66±12.14增加至921.43±13.02。以上结果表明,成功构建了重组表达载体pGEX-SrtA△N59,并在大肠杆菌中获得了可溶表达的有活性的分选酶。

无乳链球菌分选酶A的表达、纯化与活性检测

以提取的无乳链球菌ATCC51487菌株全基因组为模板,通过PCR扩增出srtAΔN82基因,经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切、抗性筛选等方法构建重组表达载体,测定不同诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间对表达产物的影响,利用亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,并使用荧光共振能量转移法测定蛋白活性。结果显示,试验构建的pGEX-6p-1-srtAΔN82载体转化至BL21(DE3)后,在37℃条件下经1 mmol/L IPTG诱导表达6 h后可得到大量的可溶性蛋白,且纯度大于85%。纯化后的SrtAΔN82与底物作用后,可显著提高反应体系的荧光强度,表明得到的SrtAΔN82具有较好的生物学活性。

分选酶的研究进展及其在生物技术中的应用

分选酶(sortase)普遍存在于革兰氏阳性细菌中,是一类膜结合的转肽酶,负责将表面蛋白共价结合到细胞壁的肽聚糖上。由于其独特的作用机制,分选酶在生物技术领域具有广阔的应用前景,可应用于革兰氏阳性菌的表面展示、蛋白质工程等。

扁桃酸对金黄色葡萄球菌分选酶A活性的抑制机制

【目的】探究扁桃酸对金黄色葡萄球菌分选酶A (SrtA)活性的抑制作用及其分子机制。【方法】采用二倍肉汤稀释法和平板涂布法研究扁桃酸对金黄色葡萄球菌的体外抑制作用;测定金黄色葡萄球菌在含有不同质量浓度扁桃酸的培养基中的生长曲线;采用结晶紫染色法测定扁桃酸对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响;通过荧光共振能量转移试验(FRET)、分子对接技术和分子动力学模拟技术研究扁桃酸对SrtA活性的抑制作用及其分子机制。【结果】扁桃酸对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均大于1 024μg/mL,在试验质量浓度范围内(0、64、128、256、512和1 024μg/mL)对金黄色葡萄球菌及其生长基本没有影响;不同质量浓度扁桃酸对金黄色葡萄球菌生物膜减少的总量有细微差异并形成一定抑制作用,并呈质量浓度依赖性;扁桃酸对SrtA活性有一定的抑制作用,其IC50为(66.15±24.39)μg/mL;扁桃酸通过多种分子间作用力与Pro-163、Val-166、Gly-167、Val-168、Ile-199和Leu-169残基紧密结合,使SrtA的构象改变从而降低活性。【结论】扁桃酸可以与SrtA的活性中心紧凑结合并相互作用形成稳定的复合物,最终抑制SrtA的生物活性,具有成为抗金黄色葡萄球菌感染抑制剂的潜力。

嗜酸乳杆菌ATCC4356分选酶A基因克隆、表达及功能分析

分选酶在细菌对宿主细胞的黏附过程中具有重要作用。为探究乳酸菌分选酶的特性及与其他致病菌分选酶的差异,以嗜酸乳杆菌ATCC4356为模板,构建分选酶A(sortase A,SrtA)重组表达载体p ET28a-SrtA_(ΔN48),转入大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)内表达,使用Dabcyl-QALPTTGEE(Edans)探究其酶活特性。结果发现:嗜酸乳杆菌ATCC4356 SrtA(Lap-SrtA_(ΔN48))分子质量为20 k Da左右;Mg^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)可提高Lap-SrtAΔN48的转肽能力;Ca^(2+)不会影响SrtAΔN48的活性,明显区别于致病菌;且分选酶抑制剂查尔酮会抑制Lap-SrtA_(ΔN48)的活性。进一步通过蛋白质同源建模分析发现Lap-SrtA由8条中心β桶状结构互相折叠而成,属于经典的分选酶结构,Lap-SrtA的活性位点为His137、Cys198、Arg205。

提高表达分选酶A的猪链球菌突变株的构建及初步评价

为了提高猪链球菌(Streptococcus suis,SS)05ZYH33菌株中分选酶A(SrtA)的表达量,本研究利用同源重组技术,将强启动子Peno、SrtA基因与红霉素抗性基因融合并转化05ZYH33野生菌株(05ZYH33-WT),构建SS SrtA提高表达的突变株05ZYH33-srtAe,并对05ZYH33-srtAe突变株和05ZYH33-WT进行生长特性分析和SrtA蛋白的western blot检测;进一步构建SS SrtA基因缺失株05ZYH33-srtA^(Δ)作为对照,通过检测05ZYH33-WT、05ZYH33-srtAe和05ZYH33-srtAΔ菌株表面蛋白SSU05_0630的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的活性,初步评价SrtA的提高表达在SS表面蛋白锚定中的作用。Western blot结果显示,正确构建了SS SrtA提高表达的突变株05ZYH33-srtAe,且该菌株的生长速度和05ZYH33-WT基本相同,但SrtA的表达量却提高了2.4倍。菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性检测结果显示,05ZYH33-srtA^(Δ)菌株的NAG活性和本实验室前期构建的SSU05_0630基因缺失株ssu05_0630^(Δ)相同,检测不到SSU05_0630蛋白的NAG活性,表明SSU05_0630蛋白是SrtA的底物,通过SrtA锚定到SS的表面。05ZYH33-srtAe和05ZYH33-WT菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性无明显差异,即SrtA表达量的提高并没有提高SSU05_0630蛋白在SS表面的锚定量。本研究首次构建了提高SS SrtA表达量的突变株,并对SrtA表达量的提高是否对SS表面蛋白锚定产生影响进行了初步探究,为进一步研究SrtA表达量的提高对SS其他表面蛋白锚定量的影响,以及优化SS表面蛋白展示系统奠定了基础。

细菌分选酶A抑制剂抗革兰阳性超级细菌感染的作用及其应用前景

过去几十年中,全球抗菌药物耐药形势愈发严峻,多重耐药菌所致感染性疾病的发病率及死亡率逐年上升。对抗菌药物耐药机制的研究发现,抗毒力疗法可能成为对抗超级细菌感染的新选择。细菌分选酶A(SrtA)是一种细菌细胞膜酶,可将关键毒力因子固定在革兰阳性菌细胞壁表面,在革兰阳性超级细菌的致病机制中起重要作用。SrtA通过识别、硫酯化和转肽化将微生物表面成分识别黏附基质分子锚定在细菌肽聚糖上,因此抑制SrtA可使细菌无法附着在特定的组织和(或)器官上,从而无法攻击宿主细胞,且无法逃避宿主的免疫反应。此外,SrtA并非细菌生长和生存所必需,在细胞膜上很容易获得,是开发抗毒力疗法药物的理想靶点。本文对合成小分子、多肽和天然产物等SrtA抑制剂的研究进展进行归纳,同时对SrtA抑制剂治疗革兰阳性超级细菌感染的应用潜力进行了分析。

盐酸血竭素对金黄色葡萄球菌分选酶A活性影响研究

为探究盐酸血竭素(DP)抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)分选酶A(SrtA)的活性及机制,本研究利用纤连蛋白黏附试验和细胞侵袭试验,验证DP通过抑制SrtA的活性影响S.aureus黏附于纤连蛋白和降低其对细胞的侵袭能力;利用荧光底物肽实验,测定DP对S.aureus SrtA的抑制作用;利用生物膜试验,观察DP对S.aureus形成生物被膜(BF)的影响能力;利用分子模拟和定点突变方法,分析验证DP对SrtA的活性中心影响作用。结果表明,DP分别在2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL和16μg/mL时,可显著性抑制S.aureus SrtA蛋白的催化活性,且这一抑制作用呈浓度依赖性;DP可以通过影响SrtA的催化活性从而阻碍其表面蛋白锚定于宿主细胞表面,进而降低S.aureus侵袭细胞的能力;DP在8μg/mL和16μg/mL时可以显著降低S.aureus与纤连蛋白结合的能力(p<0.01);DP在2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL和16μg/mL时均可以显著降低S.aureus形成BF的能力;DP可通过与SrtAΔN59中的P30和T105结合而封闭了其活性中心。综上所述,DP可作用于S.aureus毒力因子SrtA,通过抑制SrtA的活性达到减弱其毒力的效果。本研究将为DP抗S.aureus的作用机制提供参考依据。

分选酶A在小鼠链球菌性肺炎致病过程中的作用研究

目的研究肺炎链球菌分选酶A(Srt A)在小鼠肺炎致病过程中的作用。方法将肺炎链球菌野生型菌株(WT-Srt A)、Srt A基因缺失型菌株(DEL-Srt A)和Srt A基因回补型菌株(p Srt A)分别滴入相应组小鼠鼻腔,构建链球菌肺炎小鼠模型。对照组小鼠滴入等量的无菌生理盐水。用ELISA实验检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液和血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量,Western blot检测肺组织炎症信号通路JAK-STAT中p-JAK2、pSTAT3磷酸化蛋白的表达,以及NF-κB信号通路中P-IκBα、p-p65磷酸化蛋白的表达。结果与对照组相比,WTSrt A组小鼠支气管肺泡灌洗液和血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量均显著升高(P<0.05),肺组织中p-JAK2、p-STAT3、P-IκBα、p-p65蛋白表达显著上调(P<0.05);与WT-Srt A组相比,DEL-Srt A组小鼠支气管肺泡灌洗液和血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量均显著降低(P<0.05),肺组织中p-JAK2、p-STAT3、P-IκBα、p-p65蛋白表达显著下调(P<0.05);p Srt A组小鼠各项检测指标与WT-Srt A组相当。结论肺炎链球菌Srt A基因的缺失能够减弱链球菌对小鼠肺炎的致病作用,其可能的机制是通过抑制JAK-STAT和NF-κB信号通路的激活,从而减少炎症细胞因子的释放。

新抗菌靶点分选酶基因(srtA)在两种原核载体中的克隆表达

【目的】革兰氏阳性菌的表面蛋白在病原菌致病性方面具有重要作用,表面蛋白锚定到细胞壁过程的关键酶—分选酶成为抗感染的新靶点。【方法】本文利用GenBank中的分选酶A基因(srtA)序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得618bp的DNA片段。按照常规分子克隆操作成功构建两种原核表达载体pet22-srtA和pTRX-srtA,转入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中,在1mmol/LIPTG诱导下进行表达。利用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定和分析,【结果】结果显示:(1)重组载体pet22-srtA和pTRX-srtA分别表达出相对分子量为约45kDa和39kDa的外源蛋白;【结论】(2)分子伴侣硫氧还蛋白(Trx)有利于分选酶A基因的可溶性表达。该实验为后续的分选酶酶学性质研究特别是抑制剂筛选研究奠定良好基础。

酵母表面展示分选酶底物用于分选酶活性检测

【目的】以EGFP标签检测分选酶底物QALPETGEE在毕赤酵母表面的表达,然后将酵母表面展示的底物与分选酶相互作用以检测分选酶活性。【方法】以pcDNA-myc-his-EGFP为模板,通过PCR技术将QALPETGEE-linker-EGFP基因连接到穿梭载体pKFS上,构建QALPETGEE-linker-EGFP酵母表面展示载体后转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中。重组菌经培养,利用荧光显微镜检测重组酵母的荧光强度,然后通过荧光分光光度计检测分选酶与底物相互作用后产生游离的EGFP荧光强度进而确定分选酶的酶活。【结果】荧光显微镜下观察到重组酵母细胞表面有绿色荧光且强度随时间增强。荧光分光光度计检测表明,反应后上清游离的EGFP荧光强度由原先的187.67±2.16增加至273.47±2.14。【结论】这表明分选酶底物已成功展示在酵母表面,且为分选酶的活性检测提供了高效、经济的方法。

猪链球菌2型分选酶srtC5基因敲除突变菌株的构建及其特性分析

构建猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)强毒株ZY458分选酶srtC5基因敲除突变体并分析其特性。首先通过重叠延伸PCR技术扩增ΔsrtC5片段,该片段携带srtC5编码基因及其上下游部分序列,但是中间缺失212bp序列。随后构建重组自杀载体pSET4s::ΔsrtC5,并将其电转化导入ZY458菌株,通过同源重组获得ΔsrtC5突变体。通过体外的细胞黏附试验和体内的家兔攻毒试验证明ΔsrtC5突变体比较野毒株,其细胞黏附能力和对家兔的致病性都显著降低。

固定化分选酶介导的多肽环化

多肽环化修饰是提高其稳定性和生物活性的重要手段之一,本研究建立了含有适于亲和色谱纯化的6个组氨酸和几丁质结合域两个融合标签的分选酶表达系统,纯化获得了目的蛋白;酶促动力学实验结果表明融合标签对其催化活性没有影响;以N-端含有3个甘氨酸和C-端含有分选酶识别序列的线性肽为底物研究了固定化酶催化线性肽的环化,该技术操作简单,易于酶促反应产物的分离纯化和固定化酶再利用,可直接用于环肽类药物的化学-酶法合成。

土木香提取物对金黄色葡萄球菌分选酶A抑制作用

金黄色葡萄球菌耐药性较为严重,细菌性分选酶A在细菌细胞壁表面毒力蛋白锚定过程中发挥着重要作用,是细菌性感染防治的重要潜在靶点。研究通过酶活抑制试验、细胞外基质黏附试验、生物被膜形成试验和细菌侵袭试验进行了分选酶A抑制剂筛选和活性分析。结果表明:土木香提取物可显著抑制金葡菌分选酶A活性,土木香提取物处理后可显著降低金葡菌与细胞外基质黏附及金葡菌生物被膜形成。在金葡菌与宿主细胞共感染体系内加入土木香提取物后可显著降低细菌对宿主细胞的侵袭作用。说明土木香提取物可通过靶向分选酶从而抑制金葡菌的致病力,是潜在的抗金葡菌感染先导复合物。

双酶修饰制备纳米抗体靶向成像蛋白簇

通过分选酶和谷氨酰胺转氨酶催化反应制备了一种由纳米抗体和绿色荧光蛋白sfGFP组成的靶向成像探针.通过设计一类具有两种酶识别结构的树枝状聚氨基酸底物来制备偶联了纳米抗体和sfGFP的蛋白簇.该靶向蛋白簇能够特异性结合靶细胞并呈现绿色荧光信号.在肿瘤异种移植的小鼠模型中,该靶向蛋白簇能够快速富集到肿瘤部位,并在9h内逐渐被代谢排出.

毛兰素缓解金黄色葡萄球菌腹膜炎的作用机制

采用微量肉汤稀释法、荧光共振能量转移试验和分子对接技术,分别探究毛兰素对金黄色葡萄球菌的体外抑制作用、对分选酶A(Srt A)的抑制作用及其作用的分子机制;通过构建小鼠腹膜炎模型,评价毛兰素对金葡菌腹膜炎的缓解作用。结果表明:毛兰素对金葡菌的体外最小抑菌质量浓度为512μg/m L,最小杀菌质量浓度大于1024μg/m L;毛兰素对SrtA活性有明显抑制作用,IC50为(20.91±2.31)μg/m L;毛兰素以紧凑的构象结合至SrtA的活性中心,与SrtA形成稳定的复合物来影响SrtA的生物活性;毛兰素对金葡菌引起的腹膜炎有良好的缓解作用,可减轻金葡菌所导致的小鼠脓肿症状。

srtA基因调节变异链球菌氧化耐受的机制研究

目的探究srtA基因对变异链球菌氧化耐受能力的调节作用并初步探讨其机制。方法通过氧化耐受实验,对比变异链球菌UA159菌株及其srtA基因缺失株及回复株在浮游及生物膜状态下的氧化耐受能力差异;用Illumina Hiseq 4000测序平台对UA159菌株及其srtA基因缺失株在对数中期及稳定期的基因转录组测序,比较其氧化耐受相关基因的转录表达差异,进一步探讨srtA基因缺失后变异链球菌氧化耐受能力的变化与其基因转录组的内在联系;并采用qPCR来验证相关基因表达水平的变化。结果srtA基因缺失后变异链球菌在浮游状态、生物膜状态的氧化耐受能力均较UA159降低(P<0.05)。分析33个氧化耐受相关基因在转录组测序结果中的表达水平发现,过氧化物合成与代谢相关酶类基因无明显变化,但稳定期样本中双组份信号转导系统编码基因lrgA、lrgB、lytT表达下调2.2~2.4倍;qPCR结果进一步表明对数中期、稳定期的浮游菌lrgB、lytT表达下调11.01~53.51倍,且另一双组分系统编码基因vicK表达下调6.57~10.88倍(P<0.001)。结论srtA基因缺失后,变异链球菌过氧化物合成及代谢酶类编码基因表达水平不变,但氧化耐受相关转录调节因子表达水平下降,进而减弱变异链球菌的氧化耐受能力。

革兰氏阳性细菌菌毛的组装

细胞表面各种多亚基的蛋白质聚合物被称为菌毛,它在许多致病菌对特定宿主组织的定植中起着关键作用。与革兰氏阴性菌不同,革兰氏阳性菌是通过一种独特的机制来组装菌毛的,这种机制涉及到一种叫做分选酶的转肽酶。分选酶将单个的菌毛蛋白单体交联,最终将得到的共价聚合物连接到细胞壁的肽聚糖上。目前为止,针对革兰氏阴性细菌菌毛的组装机制已研究的十分透彻且被应用于多个领域,而革兰氏阳性细菌菌毛的组装机制还有待研究。本文将对已有的关于革兰氏阳性细菌菌毛的组装机制以及其在特定宿主组织定植、调节宿主免疫反应和细菌生物膜形成过程中所发挥的作用的一些研究与结论进行综述。