PEBP在切割穹窿海马伞大鼠海马中的表达变化

切割大鼠右侧穹窿海马伞,应用Western blot、免疫组化技术,观察切割后海马中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyle-thanolamine binding protein,PEBP)的表达的时空变化。Western blot结果显示:PEBP在切割后3 d表达开始上升,7 d达最高水平,随后缓慢下降,28 d时降至正常。免疫组化结果显示:术后各时间点切割侧海马CA1～CA3区的锥体细胞层和齿状回颗粒层的PEBP阳性细胞数与正常侧相比无显著性差异(P>0.05),但切割侧PEBP阳性细胞染色加深,7 d时最为明显,两侧比较灰度值有显著性差异(P<0.01)。切割侧齿状回门区和颗粒下层中可见较多深染的PEBP阳性细胞,其细胞数和灰度值与正常侧相比均有显著性差异(P<0.05)。结合本课题组以往的工作,本结果提示切割穹窿海马伞后PEBP的高表达可能与海马神经再生有关。

切割穹窿海马伞大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化——原位杂交法

目的探讨大鼠穹隆海马伞切割侧与正常侧海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法切割大鼠右侧穹窿海马伞,切割后14d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Brn-4 RNA探针进行原位杂交。每只动物随机计数3张切片切割侧和正常侧Brn-4 mRNA的阳性细胞,测定其吸光度(A)值,进行配对t检验分析。结果切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层均见Brn-4 mRNA阳性细胞,两侧细胞数无明显差异,但切割侧阳性细胞平均吸光度值较正常侧明显增加(P<0.01);而在齿状回门区和颗粒下层,切割侧Brn-4 mRNA阳性细胞数和平均吸光度值均较正常侧升高(均P<0.01)。结论穹窿海马伞切割侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层细胞中Brn-4 mRNA的表达量明显增强,而在齿状回门区和颗粒下层中,其阳性细胞数和表达量均较正常侧明显升高。结合本课题组以往的工作,提示切割穹窿海马伞后,海马中Brn-4 mRNA表达的增高可能与促进其中的神经干细胞向神经元分化有关。

切割穹窿海马伞后大鼠与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱比较

目的:比较切割穹窿海马伞后大鼠海马与正常大鼠海马蛋白质组双向电泳图谱的差异,为研究切割穹窿海马伞后大鼠海马的神经再生内环境提供实验依据。方法:制作切割双侧穹窿海马伞大鼠动物模型,术后7 d分别取切割穹窿海马伞后大鼠和正常大鼠海马组织,提取总蛋白,进行双向电泳,比较切割穹窿海马伞后大鼠与正常大鼠海马组织的蛋白质表达差异。结果:通过双向电泳软件分析,切割穹窿海马伞后大鼠海马和正常大鼠海马组织双向电泳图谱经匹配比对后发现有7个蛋白点仅在切割穹窿海马伞海马蛋白双向电泳图谱中表达,35个蛋白在两组大鼠海马组织中含量发生了2倍以上的变化,其中切割穹窿海马伞大鼠组上调31个,下调4个。结论:初步建立了切割海马伞大鼠海马比较蛋白质组学的技术方法;切割穹窿海马伞后7 d大鼠海马与正常海马蛋白表达存在明显差异,差异点的发现为今后进一步深入研究切割穹窿海马伞后大鼠海马的神经再生机制提供了实验依据。

切割穹窿海马伞大鼠海马内BLBP的表达变化

为了观察切割大鼠右侧穹窿海马伞后,切割侧与正常侧海马齿状回内脑脂结合蛋白(BLBP)的表达变化,本研究应用Western blot和免疫组织化学方法检测双侧海马内BLBP蛋白表达水平的变化,以及海马齿状回门区和颗粒下层中BLBP免疫阳性细胞数和灰度值。结果显示:正常大鼠双侧海马各区和颗粒下层细胞BLBP仅有微量表达,切割穹窿海马伞后第1 d双侧差异不明显;3 d时切割侧颗粒下层阳性细胞及染色深度较正常侧加深;5 d时切割侧颗粒下层阳性细胞数量明显增多,染色较深,并达到最高水平;7 d后BLBP免疫阳性细胞的数量和染色深度开始降低,14 d时接近正常侧水平。而切割后3、5 d时双侧门区BLBP免疫阳性细胞的数量差异不大,但切割侧染色较深,7 d后也逐渐降低,14 d时降至正常侧水平。上述结果提示,切割穹窿海马伞阻断了隔区与海马齿状回的纤维联系后,可引起海马齿状回门区和颗粒下层BLBP表达增强,可能引发了放射状胶质细胞的增殖和激活,构成的支架有助于神经干细胞的迁移和向神经元的分化。

切割穹窿海马伞大鼠海马内Lhx8 mRNA表达的变化

目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠切割侧与正常侧海马内Lhx8 mRNA表达的差异。方法:切割SD大鼠右侧穹窿海马伞。切割后7d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Lhx8 RNA探针进行原位杂交,分析切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层中及齿状回门区和颗粒下层中的Lhx8 mRNA阳性细胞的数量和平均光密度值。结果:切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层Lhx8 mRNA阳性细胞数量无明显差异,但切割侧平均光密度值较正常侧明显增加;在齿状回的门区和颗粒下层,切割侧Lhx8 mRNA阳性细胞数和平均光密度值均较正常侧升高。结论:切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA表达上调,可能与其中的神经干细胞向胆碱能神经元分化的神经再生机制有关。

切割穹窿海马伞大鼠海马IGF2及其受体IGF2R蛋白的表达变化

目的:观察穹窿海马伞切割后不同时间点海马胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor,IGF2)及其受体IGF2R蛋白的表达变化及定位。方法:应用ELISA、Western blot和免疫荧光组织化学方法检测海马内IGF2及其受体IGF2R蛋白,以及齿状回门区和颗粒下层中IGF2/Hoechst和IGF2R/Hoechst阳性细胞的数量及形态学变化。结果:(1)ELASA结果显示:IGF2在切割后7 d表达开始上升,14 d达最高水平,随后缓慢下降,28 d时降至正常水平。(2)Western blot结果显示:IGF2R也存在一个相应的表达升高与消退的过程,说明两者具有明显的相关性。(3)免疫荧光染色结果显示:正常组海马齿状回门区和颗粒下层IGF2及其受体IGF2R阳性细胞的数量较少,切割穹窿海马伞后第3 d数量稍有增多,但差异不明显;7 d时阳性细胞明显增多;14 d时阳性细胞继续增多,并达到最高水平;21 d后阳性细胞的数量开始下降,28 d时接近正常组水平。结论:切割穹窿海马伞后IGF2及其受体IGF2R的高表达可能与海马神经再生中抑制神经干细胞和放射状胶质细胞增殖,从而启动其向神经元等分化有关。

穹窿海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响

为观察成鼠神经干细胞移植入切割穹窿海马伞侧海马和正常侧海马后存活和分化为神经元的状况 ,用无血清培养和单细胞克隆技术获取成年 SD大鼠前脑室下带神经干细胞 ,进行 Brd U标记和扩增。切割 SD大鼠右侧穹窿海马伞 ,术后 2周将标记有 Brd U的神经干细胞植入双侧海马齿状回。 2月后 ,行 Nissl染色、Brd U免疫荧光、NF -2 0 0 / Brd U免疫荧光、β-tubulin- / Brd U免疫组织化学染色和 ACh E组织化学染色。结果发现 ,移植的神经干细胞在海马齿状回中存活并沿颗粒下层迁移 ,切割侧海马齿状回中有较多的 Nissl深染的大胞体神经元样细胞 ,而正常侧多为小胞体胶质样细胞。切割侧海马齿状回颗粒下层中见有数个NF-2 0 0 / Brd U、β-tubulin- / Brd U双标神经元和 ACh E阳性神经元 ,而正常侧海马中则未能见到。上述结果提示 ,移植到海马中的神经干细胞能存活、迁移 ,穹窿海马伞切割侧海马中某些物质的表达增强 ,可诱导植入其内的神经干细胞向神经元或 ACh E阳性神经元分化。

穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用

目的 探讨穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的影响。 方法 切割SD大鼠右侧穹窿海马伞 ,14d后取两侧海马制成提取液 ;将神经干细胞接种于 3块 2 4孔培养板中 ,每板分成切割组、正常组和对照组各 8孔 ,前 2组分别加入切割侧和正常侧海马提取液。第 1、2块分别于第 7d和14d时行MAP 2免疫荧光检测 ;第 3块于 10d时行AChE组织化学染色。计数MAP 2和AChE阳性神经元数 ,观察胞体大小和突起长度。 结果 切割组第 7d时MAP 2阳性神经元较多 ,胞体大、突起长 ,14d时细胞进一步迁移、成熟 ;正常组第 7d时仅见少量突起短的MAP 2阳性神经元 ,14d时细胞稍增多 ,突起稍增长 :对照组第 7d时未见MAP 2阳性神经元 ,14d时仅有少量胞体小、突起短的MAP 2阳性神经元。第 10d切割组AChE阳性神经元较多 ,突起多而长 ,正常组仅见少量无突起的AChE阳性神经元 ,对照组未见AChE阳性神经元。 结论 穹窿海马伞切割侧海马提取液可明显促进神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元。

穹窿海马伞切割后海马内NSCs的增殖和向神经元的分化

目的观察切割穹窿海马伞侧和非切割侧大鼠海马内自体神经干细胞的增殖和向神经元分化的情况。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,术后2 d腹腔注射BrdU,连续5d,于术后28 d取脑冰冻切片,进行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测。结果切割穹窿海马伞侧海马内的BrdU免疫荧光阳性细胞明显多于非切割侧,且发现有BrdU/NF-200双标神经元,而非切割侧未见到BrdU/NF-200双标神经元。结论穹窿海马伞切割后,切割侧海马内自体神经干细胞增殖加快,并可向神经元分化。

神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响

目的探讨切割穹窿海马伞及脑室给予神经生长因子(NGF)后,对大鼠海马自体神经干细胞增殖和分化为神经元的影响。方法12只SD大鼠,随机分成给药组和对照组,每组6只,切割右侧穹窿海马伞,两组切割后即时及第2d、4d向侧脑室分别注射NGF和人工脑脊液,并在术后第3～7d每日腹腔注射2次BrdU。于术后28d灌注取脑、冷冻切片,行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测。结果海马齿状回内BrdU阳性细胞数,给药组和对照组切割侧明显多于正常侧,给药组切割侧和正常侧分别多于对照组切割侧和正常侧;海马齿状回内的BrdU/NF-200双标神经元数,给药组切割侧最多,给药组正常侧和对照组切割侧较少,而对照组正常侧则无。结论切割穹窿海马伞后,可致大鼠海马齿状回自体神经干细胞增殖加快并向神经元分化,脑室施加NGF可促进其增殖和分化。

穹窿海马伞切割大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化

目的探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割海马伞后1、3、7、14、21及28 d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用半定量RT-PCR法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA表达水平的变化。结果海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3 d开始升高,14 d达到最高水平,随后下降,28 d左右恢复至正常水平。结论切割穹窿海马伞后海马内Brn-4 mRNA表达明显上调,可能与促进神经干细胞更多地向神经元和AChE阳性神经元分化有关。

RT-PCR检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内Lhx8 mRNA的表达变化

目的:探讨切割穹隆海马伞大鼠海马与正常海马内Lhx8 mRNA表达的差异。方法:36只SD大鼠随机分成6组,每组6只。1组为正常对照组,其余5组分别为切割穹窿海马伞后3、7、14、21和28 d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用半定量RT-PCR法分析穹隆海马伞切割后海马内Lhx8 mRNA的表达变化。结果:海马内Lhx8 mRNA的表达量在切割后第3 d开始升高,7 d时达到最高水平,以后逐渐下降,于28 d时恢复至正常水平。结论:切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA表达的增高可能与神经干细胞向胆碱能神经元分化的再生机制有关。

RT-PCR/Southern杂交法检测穹窿海马伞切割大鼠海马Brn-4 mRNA的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法:42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹窿海马伞后1、3、7、14、21及28d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用RT-PCR/Southern杂交方法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA的表达变化。结果:海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3d开始升高,14d达到最高水平,随后下降,28d左右恢复至正常水平。结论:切割穹窿海马伞后海马内Brn-4mRNA表达明显上调,可能与促进海马内移植的或自体的神经干细胞向神经元分化有关。

海马放射状胶质细胞体外诱导激活后PEBP蛋白的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞的侧海马提取液对放射状胶质细胞中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)表达的影响。方法:将培养的海马放射状胶质细胞接种于培养板中,分成对照组和诱导组,对照组中加入含5%正常海马提取液的DMEM/F12细胞培养液,诱导组中加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液。培养7 d后,通过免疫荧光标记法观察PEBP在放射状胶质细胞中的表达,并提取总蛋白,采用Western blot的方法观察对照组及诱导组中PEBP蛋白的表达变化。结果:PEBP蛋白在放射状胶质细胞中能够表达,诱导组的表达比对照组明显增加(P<0.05)。结论:PEBP的表达增加可能与切割侧海马提取液"激活"的放射状胶质细胞向神经元分化有关。

海马放射状胶质细胞体外诱导激活后的PEBP mRNA表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞侧海马提取液对海马放射状胶质细胞中磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)mRNA表达的影响。方法:将培养的海马胶质细胞接种于培养板中,分成诱导组和对照组,诱导组中加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液,对照组加入单纯的细胞培养液。培养7d后,提取总RNA,然后逆转录合成cDNA,用real-timePCR观察诱导组及切割组中PEBPmRNA的表达情况。结果:PEBPmRNA在放射状胶质细胞中能够表达,诱导组的表达比对照组明显增加(P<0.05)。结论:表达增加的PEBPmRNA可能与切割侧海马提取液"激活"的放射状胶质细胞向胆碱能神经元分化有关。

去神经支配大鼠海马内MTSS1的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞去神经支配大鼠海马内转移抑制蛋白1(metastasis suppressor 1,MTSS1)的表达变化。方法:SD大鼠随机分成正常组和切割穹窿海马伞后1、3、5、7、14 d组,采用Real-time PCR和免疫荧光组织化学技术观察穹窿海马伞切割后海马内MTSS1 mRNA的表达变化和MTSS1阳性细胞的分布情况。结果:(1)Real-time PCR结果显示:海马内MTSS1 mRNA的相对表达量在切割后3 d开始升高(P<0.05),5 d达到最高水平(P<0.01),7 d恢复至正常水平;(2)免疫荧光组织化学染色结果显示:MTSS1阳性细胞主要表达于海马齿状回门区及颗粒下层中,切割后5 d MTSS1阳性细胞数开始增多(P<0.01),7 d继续增多并达到高峰(P<0.01),14 d时开始下降至正常水平。结论:结合本课题组以往的工作,上述结果提示切割穹窿海马伞后MTSS1的高表达可能与海马神经再生过程中神经干细胞向神经元的分化有关。

去神经支配大鼠海马内MTSS1蛋白的表达变化

目的 :探讨切割穹窿海马伞去神经支配大鼠海马内(metastasis suppressor 1,MTSS1)蛋白的表达变化。方法:SD大鼠随机分成正常组和切割穹窿海马伞后1、3、5、7、14 d组,采用Western Blot法检测穹窿海马伞切割后海马内MTSS1蛋白表达水平的变化。结果:海马内MTSS1蛋白的相对表达量在切割后1 d开始升高(P<0.05),3 d继续升高(P<0.01),5 d达到最高水平(P<0.01),7 d开始下降(P<0.01),14 d时基本恢复至正常水平(P>0.05)。结论:切割穹窿海马伞去神经支配后海马内MTSS1蛋白表达水平明显上调,可能与海马神经再生过程中神经干细胞向神经元的分化有关。

大鼠海马去神经支配术后急性期内神经营养因子mRNA的表达变化

目的 :观察去神经损伤后海马中胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF-2),碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblastic growth factor 2,FGF-2),神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)等神经营养因子在急性期内各时间点的基因表达变化。方法 :将28只SD大鼠随机分成双侧穹窿海马伞切割后0.5、1、2、6、12及24 h组和假手术组,在穹窿海马伞切割上述各时间点后,分别取各组大鼠海马组织,并提取总RNA,利用半定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)法分析切割穹窿海马伞后海马内IGF-2、FGF-2、NGF、CNTF的m RNA表达变化情况。结果:在切割大鼠穹窿海马伞后急性期的早期阶段,0.5 h组CNTF m RNA的表达量与假手术组相比明显增加(P<0.05);NGF m RNA的表达水平在12 h和24 h时与假手术组相比明显下降(P<0.05);IGF-2 m RNA的表达水平在24 h时与假手术组相比显著减少(P<0.05);FGF-2m RNA从海马伞切割后1、2、6、12和24 h均较假手术组下降(P<0.05)。结论 :切割穹窿海马伞后CNTF m RNA急性期极早期表达较假手术组上调,可能与急性期海马对应激性损伤的保护作用有关,这将为更深层次地研究海马在去神经支配损伤后神经再生与神经修复提供新的思路。