厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件优化

【目的】优化厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件,为纤维素酶应用奠定基础。【方法】以厚垣镰孢霉HML278为研究对象,采用固体发酵方法分析其产葡聚糖内切酶的条件即发酵时间、发酵温度、接种量和培养基料液比对葡聚糖内切酶酶活力的影响,通过正交试验筛选厚垣镰孢霉固态产酶的最优发酵条件。【结果】葡萄糖浓度线性回归方程:y=0.0465x+0.0177,R 2=0.999。单因素试验中,料液比为1︰2时酶活最高,为2.86 U/mL;孢子接种量为孢子悬液1.5 mL/100g物料时酶活最高,为3.29 U/mL;发酵温度为40℃时酶活最高,为3.67 U/mL;发酵时间为4 d时酶活最高,为3.67 U/mL。正交试验显示,最优发酵条件为培养基料液比1︰2、发酵温度40℃、发酵时间5 d,葡聚糖内切酶酶活为4.15 U/mL。【结论】优化的厚垣镰孢霉固体发酵条件产葡聚糖内切酶的酶活较高,降解纤维素效果佳。

N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶的功能与机制

N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(endo-beta-N-acetylglucosaminidase,ENGase)广泛分布于各种生物中,主要通过降解错误折叠的糖蛋白,参与细胞和生命的调控。ENGase也是糖链编辑的有效工具酶,可专一性水解游离寡糖链及糖肽或糖蛋白上核心五糖的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)之间的β-14糖苷键。其水解产物是寡糖链和一个GlcNAc,或带有一个GlcNAc的糖肽或糖蛋白。本文对ENGase的发现、分布、蛋白质结构、酶学反应及生物学功能进行阐述,为ENGase的生物学研究提供思路,为糖生物学与糖组学的应用研究奠定基础。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1在肿瘤发生发展及治疗中的作用研究进展

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)是一种具有DNA修复和转录调控双重功能的蛋白质,其在肿瘤细胞中的高表达与肿瘤发生发展紧密相关。激素如17β-雌二醇可促进APE1/Ref-1的分泌,影响其表达。APE1/Ref-1抑制剂,如C10和E3330,已在实验中显示了抑制肿瘤细胞增殖和增强化疗药物敏感性的潜力,但APE1/Ref-1抑制剂的临床应用安全性和最佳时机需更多研究探讨。

血清脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1自身抗体、生长分化因子15水平对结直肠癌患者术后复发转移的预测价值

目的分析血清脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1自身抗体(APE1-AAbs)、生长分化因子15(GDF-15)水平及对结直肠癌患者术后复发转移的预测价值。方法选取52例结直肠癌患者为观察组,并根据预后情况分为术后复发转移组(n=15)和术后未复发转移组(n=37)。选取同期正常体检健康者52例为对照组。检测APE1-AAbs、GDF-15水平。采用Pearson相关性分析法分析APE1-AAbs、GDF-15与结直肠癌术后复发转移的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析APE1-AAbs、GDF-15对结直肠癌术后复发转移的预测价值。结果观察组的APE1-AAbs、GDF-15水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。术后复发转移组的APE1-AAbs、GDF-15水平高于术后未复发转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。APE1-AAbs、GDF-15水平与结直肠癌术后复发转移呈正相关(P<0.05)。APE1-AAbs、GDF-15联合预测结直肠癌术后复发转移的价值高于APE1-AAbs、GDF-15单独预测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论APE1-AAbs、GDF-15在结直肠癌患者血清中呈高表达。APE1-AAbs、GDF-15或可作为结直肠癌术后复发转移的标志物。

减数分裂内切酶1高表达对肝细胞癌预后的影响

目的探讨减数分裂内切酶1(EME1)的高表达对肝细胞癌(HCC)预后的临床意义。方法利用癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库及高通量基因表达(GEO)数据库,对HCC肿瘤与非肿瘤组织差异表达基因进行筛选并进行生存分析。回顾性收集2010年1月-2014年12月于解放军总医院第五医学中心行肝癌切除术的80例患者的病理组织样本,采用免疫组织化学法检测EME1的表达情况,进行生存分析,评估EME1对肝癌患者术后5年生存率的影响;采用基因富集分析预测EME1在HCC中的功能。结果TCGA数据库筛选出371例HCC癌组织及50例非肿瘤组织样本,分析显示EME1 mRNA在HCC癌组织中明显高表达。筛选GEO数据库中的107例样本(包括70例HCC癌组织,37例非肿瘤组织),癌组织的EME1 mRNA表达量明显高于非肿瘤组织(P<0.05)。生存分析显示EME1高表达组术后5年总体生存率明显低于低表达组(44.1%vs.53.0%,P<0.05)。免疫组化结果半定量分析显示,EME1高表达组的总体生存率明显低于低表达组(32.8%vs.45.0%,P<0.05),多因素COX分析显示,EME1高表达[风险比(HR)=2.234,95%CI 1.073~4.649,P=0.032]和中国肝癌分期(CNLC)高分期(HR=4.317,95%CI 1.799~10.359,P=0.001)是影响HCC患者术后5年生存率的独立危险因素。结论EME1在HCC组织中高表达,并与HCC患者的不良预后相关,可作为HCC治疗的潜在靶点。

胰蛋白酶与赖氨酸C端内切酶不同顺序酶切对蛋白质组样本制备的影响

在基于质谱的蛋白质组学研究中,深度高效的蛋白质酶解是确保蛋白质被充分酶解,提升蛋白质鉴定深度(包括鉴定蛋白质数目以及蛋白质氨基酸序列覆盖率等)的关键。胰蛋白酶(trypsin)由于其能够特异性酶解精氨酸和赖氨酸羧基端,是基于质谱技术的蛋白质组学领域应用最为广泛的蛋白酶。然而,研究发现,胰蛋白酶对于赖氨酸残基的切割存在一定的遗漏酶切效率。因此,在实际蛋白质组学样本制备中,会采用胰蛋白酶和赖氨酸C端内切酶(LysC)联合使用的方式,确保赖氨酸残基的充分酶切。我们的研究发现,常用的LysC-Trypsin串联酶切的方式,会因首先加入的LysC对后续加入的胰蛋白酶进行切割,从而影响了胰蛋白酶对蛋白质样本的酶切效果。因此,本研究进行了LysC和胰蛋白酶串联酶切顺序的调整,即首先进行胰蛋白酶酶切,再加入LysC酶进行切割。本文全面比较了Trypsin-Trypsin(T-T)、LysC-Trypsin(L-T)和Trypsin-LysC(T-L)3种不同的顺序酶切方法对蛋白质样本制备质量的影响,结果表明,Trypsin-LysC顺序酶切方法在不增加实验成本的条件下,不仅获得最低的蛋白质赖氨酸/精氨酸遗漏酶切位点数目,而且酶解后得到的肽段氨基酸序列长度适中,使得Trypsin-LysC酶切后肽段样本更有利于反相色谱吸附和分离,以及串联质谱检测,从而最终显著提升样本中蛋白质的检测深度和蛋白质氨基酸序列覆盖率。本文工作为蛋白质样本的溶液内顺序酶切提供了新的技术方案和参考依据。

沉默减数分裂内切酶1(EME1)抑制肝癌细胞增殖的机制

目的探讨减数分裂内切酶1(EME1)在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法筛选TCGA数据库肝癌样本中的差异表达基因。采用免疫组化和Western Blot分析EME1在肝癌组织中的表达丰度。通过短发夹RNA(shRNA)构建慢病毒并感染BEL-7404细胞干扰EME1基因表达,分为沉默组(shEME1)和对照组(shCtrl)。通过实时荧光定量PCR法和Western Blot检测两组EME1 mRNA和蛋白表达水平,Celigo计数法及MTT活性检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期,Caspase3/7活性检测细胞凋亡。两组间比较采用成组t检验。结果TCGA结果显示EME1的mRNA表达水平在肝癌组织中是癌旁组织的18.9倍(114.5±153.0 vs 8.0±7.2,t=5.00,P<0.001);EME1的蛋白表达水平在肝癌组织中是癌旁组织的7.0倍(免疫组化检测,8.4±2.6 vs 1.2±0.4,t=7.55,P<0.001)和2.5倍(Western Blot检测,249.0%±35.5%vs 100.0%±77.8%,t=3.02,P<0.05)。慢病毒感染后,相对于对照组,沉默组EME1的mRNA表达水平下降了29.9%(29.9%±0.9%vs 100.0%±3.6%,t=32.82,P<0.001),蛋白表达水平显著下降了35.7%(35.7%±14.9%vs 100.0%±28.9%,t=3.42,P<0.05);细胞计数下降了45.1%(4053±167 vs 8988±477,t=16.91,P<0.001)、细胞活性下降至66.9%(0.518±0.046 vs 0.774±0.022,t=8.74,P<0.001)及细胞克隆形成能力下降至29.0%(75±6 vs 260±9,t=28.92,P<0.001)。与对照组比较,沉默组G1期细胞(49.9%vs 44.0%,t=8.96,P<0.001)比例增多,G2/M期(15.9%vs 17.9%,t=9.13,P<0.001)与S期(34.2%vs 38.1%,t=6.91,P<0.001)的细胞比例减少;Caspase3/7活性增强了1.5倍(145.8%±5.9%vs 100.0%±2.3%,t=12.50,P<0.001)。结论EME1在肝癌组织中高表达,沉默EME1基因可抑制肝癌细胞增殖,促进细胞凋亡。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

玛巴洛沙韦:首个靶向于Cap-依赖性核酸内切酶的抗流感药物

玛巴洛沙韦是首个Cap-依赖性内切酶抑制剂,通过抑制流感病毒RNA聚合酶酸性蛋白亚基内切酶活性,从而抑制流感病毒的复制。玛巴洛沙韦于2022年8月通过美国食品药品监督管理局(FDA)审批,在临床上用于治疗5岁及以上、流感症状不超过48 h的急性无并发症流感患者,并于2023年3月获得中国国家药品监督管理局正式批准。临床试验表明,玛巴洛沙韦具有单剂量给药、安全性高等优势,将成为儿童流感患者的替代药物。

限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位稀有突变

目的研究限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测KRAS基因第12位密码子稀有突变的可行性。方法将采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选检测方法作为实验组,限制性内切酶酶切联合蓝白斑筛选检测方法作为对照组。对照组将KRAS基因第12位密码子突变型(MUT)/野生型(WT)(MUT/WT 12)质粒按0∶1、1∶300、1∶1000、1∶3000的比例混合,限制性内切酶酶切PCR产物,酶切后产物进行蓝白斑筛选。实验组将MUT/WT 12质粒按0∶1、1∶3000、1∶10000、1∶30000的比例混合,在对照组方法的基础上酶切产物去磷酸化后再蓝白斑筛选。比较两组蓝白斑克隆数。限制性内切酶酶切鉴定实验组MUT/WT 12为1∶30000的阳性克隆,一代测序阳性克隆验证插入片段的序列。采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选验证26例肺癌病例游离DNA的KRAS基因第12位稀有突变。结果对照组1∶3000的培养皿上白色克隆17个,蓝色克隆2329个,白色/蓝色克隆为1/137;而实验组1∶30000的培养皿上白色克隆23个,蓝色克隆394个,白色/蓝色克隆为1/17,1∶30000实验组白色/蓝色克隆比例明显高于1∶3000对照组。实验组1∶30000培养血上5个阳性克隆酶切鉴定出3个阳性,其插入片段为KRAS第12位突变片段。限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选26例肺癌病例可检测出2例为KRAS基因第12位密码子突变。结论采用限制性内切酶酶切后去磷酸化联合蓝白斑筛选可检测出1∶30000 KRAS基因稀有突变。

β-1,3-葡聚糖内切酶合成、制备及应用研究进展

β-1,3-葡聚糖内切酶是一类广泛存在于细菌、真菌和某些植物中,并能够水解β-葡聚糖产生不同分子量葡聚糖的酶。低分子量葡聚糖具有抗菌、抗氧化、免疫调节和抗肿瘤的生理活性,已在医药、食品、化工等多个领域显现良好的应用前景。目前生产低分子量葡聚糖的方法主要包括物理、化学和酶降解法。相较于物理和化学降解法,酶降解法具有催化效率高、反应条件温和、收率高及对环境友好等特点,但现阶段已开发的β-1, 3-葡聚糖内切酶的酶活性和稳定性仍无法满足工业化生产的需求。因此,开发适用于工业化生产的β-1,3-葡聚糖内切酶,已成为跨越通过降解高分子量葡聚糖制备低分子量葡聚糖技术壁垒的关键。本文系统介绍了β-1,3-葡聚糖内切酶的合成调节、特点、用于低分子量葡聚糖的制备以及工艺的优化等方面的研究进展,为促进β-1,3-葡聚糖内切酶的研究和工业化应用提供参考。

赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化

首先在产酶溶杆菌来源的赖氨酰内切酶(Lys-C)成熟肽序列的N端和C端分别融合人工前肽(MGSK)和6×His标签,将密码子优化后的序列插入表达载体pET-28a;其次以IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导型启动子PT7控制Lys-C的高效表达,并针对重组菌株JM109DE3_PT7-LysC开展生物反应器高密度发酵生产Lys-C;再次收集和溶解包涵体得到Lys-C变性液,通过Sephadex G25层析脱除DTT(二硫苏糖醇),并在Lys-C复性液中添加前导肽(pre-N-pro)辅助成熟肽蛋白折叠;进一步通过切向流过滤、Ni NTA-Sepharose亲和层析和Sephacryl S-100层析等一系列纯化步骤,获得高纯度的重组Lys-C;最后进行酶切三肽底物和门冬胰岛素前体检测,分析重组Lys-C的活性水平。结果表明:重组Lys-C的发酵产量为2.4 g/L,经复性和纯化后的终产量可达48 mg/L;添加80 mg/L pre-N-pro促进了重组Lys-C的复性,复性后酶活相比于未添加pre-N-pro时提升了4.8倍,最高可达到13.8 U/L;经过多步纯化后,重组Lys-C的比酶活为10.2 U/mg,且对于门冬胰岛素前体的酶切转化率可达93.5%。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白1对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞凋亡与自噬的影响

目的探究Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白1(NEIL1)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的晶状体上皮细胞(LECs)凋亡与自噬的影响。方法以年龄相关性白内障(ARC)患者、接受透明晶状体摘除术的黄斑前膜患者的晶状体前囊膜样本和晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞为研究对象,采用RT-PCR实验检测NEIL1 mRNA表达。将SRA01/04细胞随机分为对照组、OE-Vector组和OE-NEIL1组,采用RT-PCR和Western blot检测过表达效率;将细胞随机分为对照组、H_(2)O_(2)组、OE-Vector H_(2)O_(2)组、OE-NEIL1 H_(2)O_(2)组,采用CCK-8法检测细胞活力,Western blot检测自噬相关蛋白(ATG7、P62、Beclin1、LC3-I和LC3-II)和凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的表达,荧光染色检测细胞凋亡与线粒体膜电位情况。结果ARC患者晶状体前囊膜样本中的NEIL1 mRNA表达显著低于黄斑前膜患者,且H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中NEIL1 mRNA的表达同样低于对照组(均为P<0.05)。RT-PCR与Western blot检测结果显示,OE-NEIL1组SRA01/04细胞中NEIL1 mRNA和蛋白表达均显著高于OE-Vector组(均为P=0.000)。与对照组相比,H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中细胞活力显著降低;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调;Mito-Tracker标记活细胞数显著减少,Annexin V-FITC标记的凋亡细胞数显著增多,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与OE-Vector H_(2)O_(2)组相比,OE-NEIL1 H_(2)O_(2)组SRA01/04细胞中细胞活力显著升高;自噬相关蛋白(ATG7、P62、Beclin1、LC3-I和LC3-II)表达均显著上调;Bax蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调;Mito-Tracker标记的活细胞数增加,Annexin V-FITC标记的凋亡细胞数减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论在H_(2)O_(2)诱导氧化应激条件下,NEIL1可通过促进LECs的自噬,维持LECs内环境稳定,增加其细胞活力从而减少LECs凋亡,参与ARC的发生发展。

限制性内切酶的无细胞快速制备研究

限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶,目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产,由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性,在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性。而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵活高效、无细胞毒性等优势,因此,本研究利用无细胞蛋白合成(cellfree protein synthesis,CFPS)技术进行限制性内切酶的表达制备。本课题组选择3种限制性内切酶Eco RⅠ、BamHⅠ和BsaⅠ作为研究对象,构建线性DNA为表达模板,无需甲基化酶对宿主的保护,在6 h内即可完成蛋白表达。经亲和色谱与凝胶色谱两步纯化,得到了纯度高(95%左右)、酶活相当(EcoRⅠ3.7×10^(5)~3.7×10^(6)U/mg,BamHⅠ8.3×10^(2)~4.1×10^(3)U/mg,BsaⅠ4.4×10^(5)~4.4×10^(6)U/mg)的目标蛋白。同时,建立了限制性内切酶的实时酶活检测方法,将有助于限制性内切酶的催化和快速筛选研究。本研究所开发的限制性内切酶无细胞表达制备体系,从基因模板构建到纯化蛋白所需时间短(1~2 d)、蛋白产量高(32.5~130 mg/L无细胞反应)、制备效率高(1.3×10^(5)~5.7×10^(8)U/L无细胞反应),具有较好的普适性,为限制性内切酶的研发与制备生产提供了新的思路。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。

限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析

限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明,Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5~8.5,反应依赖于Mg^(2+)和Mn^(2+)等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证。总之,本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。

基于识别重叠序列特性的限制性内切酶的重组表达策略研究

甲基转移酶可以保护宿主基因组DNA免受限制性内切酶的消化,根据这一特性,经典的限制性内切酶制备策略是首先通过表达与其配对的甲基转移酶来保护宿主菌株,然后再共表达限制性内切酶,即“一对一”的重组表达模式。作者设计了一个新的策略:通过共表达识别重叠序列的甲基转移酶来保护宿主菌株,以制备限制性内切酶。首先将识别重叠序列的甲基转移酶转入大肠杆菌ER2566,以保护宿主基因组DNA,然后将能识别重叠序列的多个限制性内切酶分别转入该宿主菌株,以进行限制性内切酶的重组表达,即“一对多”的重组表达模式。根据这一方法,利用甲基转移酶M.Esa Dix5 I、M.Alu I和M.Hha I实现了识别重叠序列(TTAA、AGCT和GCGC)的一系列限制性内切酶的重组表达,还利用甲基转移酶M.Alu I成功实现了两个新的R.Sac I同裂酶R.Eco SP4ORF25090P和R.Gma5ORF28P的重组表达。该方法简化了对抵抗限制性内切酶消化的宿主菌株的大量筛选工作,并提供了大规模制备限制性内切酶的能力。这一方法也可用于发现其他微生物中新的同工酶或同裂酶。

限制性内切酶Bsa I的分离纯化与结晶及其硒代衍生物的制备

目的:筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法。方法:本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物。首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I,转化到大肠杆菌(E.coli)ER2566中进行表达,并采用亲和层析和阴离子交换层析进行纯化。然后利用质谱、圆二色谱的方法测试硒代蛋白衍生情况,并对其进行酶活测定。最后采用坐滴法进行初步的晶体生长研究。结果:通过两步纯化方法获得了纯度大于90%的重组Bsa I和Se-Bsa I硒代蛋白;经质谱检测发现重组Se-Bsa I蛋白中的11个甲硫氨酸全部硒代,圆二色谱检测和酶活测试确定了硒代对Bsa I蛋白的结构和活性无明显影响。结晶实验显示重组Bsa I蛋白不仅可以在0.2 mol/L酸镁四水合物、pH6.5的0.1 mol/L二甲胂酸钠三水合物、20%聚乙二醇8000的条件下生长出颗粒状结晶,而且可以在pH4.6的0.1 mol/L三水醋酸钠、2 mol/L硫酸铵的条件下生长出球状结构晶体。结论:本研究成功实现了BsaI蛋白及其硒代蛋白的重组表达,并对蛋白晶体条件进行初筛,旨为解析BsaI蛋白三维结构提供一定的参考。

肺鳞状细胞癌组织中Flap-核酸内切酶1和复制因子C2的表达及临床意义

目的探讨肺鳞状细胞癌组织中Flap-核酸内切酶1(Flap-endonuclease 1,FEN1)和复制因子C2(replication factor C2,RFC2)的表达及其临床意义。方法采用生物信息学方法分析FEN1、RFC2在肺鳞状细胞癌组织中的表达;采用免疫组化法检测80例肺鳞状细胞癌及癌旁组织中FEN1和RFC2蛋白的表达,利用RT-PCR法检测两者mRNA表达并分析相关性,分析FEN1、RFC2与临床病理特征的关系;收集患者随访资料,绘制患者的生存曲线。结果FEN1和RFC2在肺鳞状细胞癌组织中的高表达率分别为77.50%(62/80)、70.00%(56/80),在癌旁组织中的高表达率分别为42.50%(34/80)、32.50%(26/80),与公共数据库分析结果一致。RT-PCR结果显示,肺鳞状细胞癌组织中RFC2、FEN1 mRNA表达均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01);相关性分析结果显示,两者的表达存在明显正相关。不同TNM分期患者的FEN1、RFC2蛋白表达差异有统计学意义,是否存在胸膜侵犯与RFC2蛋白的表达差异有关。FEN1、RFC2高表达肺鳞状细胞癌患者的总生存期均低于低表达组。单因素分析结果表明:RFC2高表达、FEN1高表达、TNM分期与肺鳞状细胞癌患者的预后有关;多因素分析结果表明:TNM分期、FEN1和RFC2高表达是影响肺鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素。结论FEN1和RFC2有助于评估肺鳞状细胞癌患者的预后,两者之间存在协同作用,可能成为新的肿瘤标志物。