划痕标记染料示踪技术检测几种环境致癌物初探

划痕标记染料示踪技术检测几种环境致癌物初探曹波，高宁，张晓丽，邱志群，卓鉴波第三军医大学环卫教研室（重庆６３００３８）随着工业的发展，全世界每年合成数以千计的新化学物质，据研究表明，人类８０％的致癌因素来源于环境中化学物质。Ａｍｅｓ试验是一种重要的检...

应用划痕标记染料示踪技术检测草苁蓉甲醇提取物对大鼠肝癌细胞功能的影响

目的：通过划痕标记染料示踪实验,初步筛选出对大鼠肝癌细胞G JIC功能有较强恢复和促进作用的草苁蓉甲醇提取物药物终浓度。方法：大鼠肝癌细胞随机分为5个组：分别为1个对照组、4个实验组。4个实验组加入草苁蓉甲醇提取物药物终浓度分别达到0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L。结果：大鼠肝癌细胞经草苁蓉甲醇提取物（BR）0.75g/L、1.0g/L作用48h后的细胞中,荧光染料出现在划痕的附近细胞内至划痕以外的5~6列甚至7~8列细胞内,半定量为（）,形成连片状的荧光染色,荧光亮度明显增加,细胞间染料传输功能显著增强。结论：通过划痕标记染料示踪实验,初步筛选出草苁蓉甲醇提取物0.75、1.0g/L对细胞G JIC功能有较强恢复和促进作用。

划痕标记染料示踪技术用于环境致癌物的检测

划痕标记染料示踪技术用于环境致癌物的检测张晓丽高宁卓鉴波邱志群曹波目前，快速检测环境致癌物的方法均以体细胞突变学说为基础，有人提出可以把细胞间隙连接通讯（ＧＪＩＣ）的检测作为检测致癌物尤其是非遗传毒性致癌物及促癌物的一个有效手段［１］。本研究的目的是...

缺血再灌注后心肌细胞缝隙连接通讯改变与其凋亡及坏死的关系

目的:了解不同缺血再灌注时间心肌细胞缝隙连接通讯改变情况,分析心肌细胞缝隙连接通讯与心肌细胞坏死、凋亡的关系以及卡维地洛、庚醇的干预作用。方法:实验于2004-10/2005-03在中日友好医院临床研究所完成。取培育7d心肌细胞缺氧30min后换用正常含糖的DMEM培养基培养1,2,3,6h,造成再给氧损伤。给药方案:分为三组;未用药组,庚醇组,卡维地洛组。庚醇用DMEM(含5%的小牛血清)配成1,2mmol/L的浓度,卡维地洛配成0.001g/L的浓度,分别加入药物于受试细胞,培养细胞30min后再做相关实验。未用药组不加药。采用细胞划痕技术,在倒置荧光显微镜下直观地观察不同组别、缺氧再灌注不同时间罗氏黄经过缝隙连接流通情况。利用流式细胞仪观察缺氧再灌注不同时间细胞凋亡情况。结果:①在缺氧30min时心肌缝隙连接通讯明显下降,荧光仅传至划痕附近第二列细胞,正常细胞荧光则传至四列以外的细胞。再供氧1h时恢复到第三列,以后逐步恢复到正常。运用庚醇后传导明显减慢荧光仅传至第二列细胞,缺氧和再供氧时传导也无明显变化。运用卡维地洛后传导改变不明显。②正常和缺血30min时凋亡指数差异无显著性(P>0.05),再供氧1h凋亡指数为27.4%,与正常相比差异显著(P<0.01)。坏死的心肌细胞在再供氧2h后差异有显著性(P<0.01)。运用卡维地洛、庚醇后凋亡指数在再灌注1h时分别较未用药组减少了55.11%,21.53%。③培养7d的心肌细胞搏动频率为(120±18)次/min,缺氧30min时,搏动减弱,次数为(56±16)次/min,再供氧1h时,搏动次数为(118±22)次/min,两者差异显著(P<0.01)。加入浓度为2mmol/L的庚醇后,心肌细胞搏动明显减弱,约为(64±20)次/min,差异显著(P<0.001)。加入0.001g/L卡维地洛搏动次数也有不同程度的减低(P<0.05)。在缺氧再灌注过程中,两个干预组搏动次数变化不大。结论:心肌细胞在缺氧时缝隙连接通透性减低,庚醇、卡维地洛也有不同程度的降低缝隙连接通讯的作用。庚醇、卡维地洛通过改变缝隙连接通讯以及其他方面的作用来减少心肌细胞的死亡和凋亡。

高糖对人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞间通讯的影响

【目的】研究高糖对人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞通讯活性(GJIC)的影响。【方法】将人晶状体上皮细胞(SRA01/04)培养于正常葡萄糖浓度(5.5mmol/L),传代时将其接种于16个35mm的培养皿中,实验分为4组(每组4个培养皿):正常糖浓度组(培养基葡萄糖含量是5.5mmol/L)、高糖组(培养基葡萄糖含量是30mmol/L)、佛波酯(TPA)组(阳性对照)及二甲基亚砜(DMSO)组(阴性对照)。当细胞生长至90%融合时,用划痕荧光染料示踪技术(SL/DT)检测其缝隙连接细胞间通讯活性。【结果】在高糖培养的人晶状体上皮细胞划痕荧光黄向两侧传递的细胞列数为2.23±0.33,明显少于正常糖浓度培养的人晶状体上皮细胞(3.75±0.57,P<0.01)。TPA显著抑制晶状体上皮细胞的GJIC,与正常糖浓度组比较差异具有显著性(1.65±0.26vs3.75±0.57,P<0.01)。【结论】人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞间通讯活性在高糖中受到抑制,可能在糖尿病晶状体渗透水肿和离子代谢紊乱中发挥作用。

细胞移植示踪技术的研究进展

细胞移植替代疗法已成为现代医学中发展最为迅速的领域之一，移植细胞在宿主体内的存活、增殖、迁移和分布也自然受到人们的极大关注。目前移植细胞的示踪方法可归纳为5类：（1）利用荧光染料标记细胞，

大鼠肝卵圆细胞增殖模型肝脏的GJIC功能和意义

目的:研究大鼠肝卵圆细胞(HOC)增殖模型肝脏缝隙连接蛋白32,43(CX)的表达及缝隙连接细胞间通讯(GJIC)的功能,探讨HOC增殖的可能机制.方法:健康(?)Wistar大鼠,随机分成正常对照组(n=6),模型组.模型组大鼠按每天20 mg/kg剂量灌喂2-AFF,连续4 d,第5天不灌喂行2/3肝切除,术后次日按每天20 mg/kg剂量继续灌喂5 d(2-AFF/PH).模型组在术后4h,4,8,12和16d随机取6只大鼠检测.采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组化和细胞形态学方法计数HOC;切开标记/染料示踪技术(incision loading/dye transfer,IL/DT)技术确定GJIC;免疫组化及RT-PCR技术检测CX32蛋白及mRNA表达;免疫组化、Western blot及RT-PCR技术分析CX43蛋白及mRNA水平.结果:对照组及模型组4 h未见HOC增殖.模型组4d汇管区有HOC增殖反应,8d HOC增殖达峰值,12d HOC从汇管区向肝实质内浸润,16d HOC增殖减少较12 d减少;IL/DT检测结果显示,模型组各时点(4h,4,8,12和16d)染料扩散距离低于对照组(84.5±3.4,60.6±3.3,108.6±4.2,150.6±2.6,199.6±3.7μm vs 250.0±5.0 um,P<0.01),GJIC功能降低.模型组各时点CX32表达均低于对照组(P<0.05),在4 h下调,4d达低峰(2.85±0.39),8d后逐渐恢复;RT-PCR显示模型组CX32 mRNA在4h开始下降,4d达低峰(0.33±0.11),8 d后逐渐恢复,16 d高于对照组,但无显著差异(P>0.05).Western blot结果显示模型组CX43蛋白表达在4 h上调(P>0.05)、4-16 d明显升高;RT-PCR显示模型组4h CX43 mRNA上调(P>0.05),4 d表达明显升高,12 d达高峰(5.46±0.58),16 d低于对照组,但无显著差异(P>0.05).结论:采用Solt-Farber方法成功建立了HOC增殖动物模型;大鼠2-AAF/PH肝脏CX表达呈时空特异性变化,使肝脏GJIC功能抑制.肝脏的GJIC抑制可能启动了HOC增殖.

细胞间缝隙连接通讯改变在神经系统疾病中的应用

细胞间缝隙连接通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）概念的提出已达40年，随着划痕标记染料示踪（scrape—loading and dye transfer，SLDT）技术和激光扫描共聚焦显微镜下荧光淬灭后恢复（fluorescence redistribution after photobleacing，FRAP）技术的创立，使得近10余年来各学科关于细胞间缝隙连接通讯的研究快速发展，业已成为生命科学的研究热点之一。

缺氧再复氧对心肌细胞缝隙连接通信影响的研究

目的研究不同缺氧再复氧时间心肌细胞缝隙连接(Gap junction,GJ)通信改变情况,以及庚醇(Heptanol,HT)对GJ通信的影响。方法利用荧光染料Lucifer yellow CH(LY)不能透过细胞膜,但可以经过细胞GJ在细胞间进行传递的特点,采用细胞划痕技术,在倒置荧光显微镜下直观地观察不同组别、缺氧再灌注不同时间LY经过GJ流通情况,及HT干预后GJ通信改变情况。结果在缺氧30min时心肌GJ通信明显下降,荧光仅传至划痕附近第二列细胞,正常细胞荧光则传至四列以外的细胞。再供氧1h时恢复到第三列,以后逐步恢复到正常。运用HT后传导明显减慢荧光仅传至第二列细胞,缺氧和再供氧时传导也无明显变化。培养7d的心肌细胞搏动频率为(120±18)次/min,缺氧30min时,搏动减弱,次数为(56±16)次/min,再供氧1h时,搏动次数为(118±22)次/min,两者差异显著(P(0.01)。当运用HT后心肌细胞搏动明显减弱,约为(64±20)次/min,差异显著(P(0.001)。在缺氧再灌注过程中,HT搏动次数变化不大。结论心肌细胞在缺氧时GJ通透性减低,HT也有不同程度的降低GJ通信的作用。

乳腺癌哨兵淋巴结检测

乳腺癌哨兵淋巴结 (SLN )活检技术旨在提高生活质量 ,降低并发症及手术对患者损伤 ,并有望替代腋窝淋巴结清扫术。

肝脏GJIC对大鼠体内肝卵圆细胞增殖的影响

目的:研究肝脏缝隙连接细胞间通讯(GJIC)对大鼠体内肝卵圆细胞(HOC)增殖的影响.方法:健康♂Wistar大鼠,随机分成对照组(n=6)、模型组、苯巴比妥(Phenobarbital,PB)组.模型组大鼠按每天20 mg/kg剂量灌喂2-AFF,连续4 d,第5天不灌喂行2/3肝切除,术后次日按每天20 mg/kg剂量继续灌喂5 d (2-AFF/PH);PB组予以0.8 g/L PB饮水7 d,第8天按模型组处理,0.8 g/L PB饮水持续至实验结束.模型组、PB组在术后4 h,4,8,12和16 d随机取6只大鼠检测.采用组织病理技术观察肝组织的形态学变化;免疫组化和细胞形态学方法计数HOC;切开标记/染料示踪技术(incision loading/dye transfer,IL/DT)技术确定GJIC:免疫组化及RT-PCR技术检测CX32蛋白及mRNA表达:免疫组化、Western blot及RT-PCR技术分析CX43蛋白及mRNA水平.结果:对照组及模型组和PB组4 h未见HOC增殖.模型组4 d汇管区有HOC增殖反应,8 d HOC增殖达峰值,12 d HOC从汇管区向肝实质内浸润,16 d HOC增殖较12 d减少.与模型组比较PB组4-16 d各时点HOC明显增加(P<0.01);IL/DT显示各时点模型组大鼠肝脏GJIC均低于对照组(P<0.01),与模型组比较PB组各时点GJIC进一步降低(P>0.01):模型组、PB组各时点CX32的表达低于对照组(P<0.05),与模型组比较PB组CX32表达在4 h,12,16 d时点减少(P<0.05),在4,8 d时点表达增多(P<0.05):模型组4 h-16 d时点CX32 mRNA水平分别为对照组的0.82±0.13,0.33±0.11,0.51±0.13,0.68±0.14,1.12±0.18倍,与模型组比较PB组4 h时点无显著差异(P>0.05),4-16 d时点明显升高(P<0.05).模型组4 h-16 d各时点CX43蛋白表达分别为对照组的1.14±0.17,3.87±0.35,5.28±0.48,2.96±0.33,2.12±0.19倍,与模型组比较PB组CX43蛋白4 h上调(P>0.05),4-16 d明显减少(P<0.05).模型组4 h-16 d各时点CX43 mRNA水平分别为对照组的1.09±0.16,2.82±0.23,5.46±0.58,3.34±0.64.0.91±0.11倍.与模型组比较PB组各时点CX43 mRNA表达上调(P<0.05).结论:改变大鼠2-AAF/PH模型肝脏CX32、CX43的时空表达模式,降低肝脏肝细胞及HOC与其偶联细胞的GJIC,可解除HOC生长抑制,促进HOC的增殖.

不同恶化程度胃癌细胞系的细胞间隙连接通讯功能及Cx43表达的差异

以人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1和不同恶化程度的人胃癌细胞系(低恶化AGS细胞系、中恶化SGC-7901细胞系、高恶化BGC-823细胞系)为研究对象,采用激光共聚焦显微镜的荧光漂白恢复技术及划痕标记荧光染料示踪技术研究不同恶化程度的胃癌细胞系细胞间隙连接通讯(Gap junctional intercellular communication,GJIC)功能的差异;采用荧光定量PCR技术和间接免疫荧光技术检测间隙连接蛋白(Connexin43,Cx43)基因在mRNA和蛋白水平的表达差异,探求其与胃癌恶性程度的相关性.结果表明,在正常胃细胞系和低、中及高恶化胃腺癌细胞系中,细胞间的GJIC功能随着恶性程度的升高而减弱(AGS、SGC-7901)或消失(BGC-823),且Cx43蛋白及mRNA的表达量随着恶性程度的升高而下调(AGS、SGC-7901)或缺失(BGC-823).这提示胃癌恶性程度与胃癌细胞的GJIC功能显著相关(P<0.05),GJIC在胃癌发生中起重要作用.

头花蓼对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的细胞间隙连接通讯功能的影响

目的探讨头花蓼对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞间隙连接通讯功能的影响。方法采用划痕标记荧光染料示踪技术检测不同比例(幽门螺旋杆菌与细胞之比为25∶1,50∶1,100∶1)的幽门螺旋杆菌数对胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞作用24h后间隙连接通讯功能的影响。构建幽门螺旋杆菌相关性胃炎(Helicobacter pylori-associated gastritis,HPAG)细胞模型基础上,采用划痕标记荧光染料示踪技术检测不同浓度的头花蓼(8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL)作用24h后对幽门螺旋杆菌相关性胃炎的细胞间隙连接通讯功能的影响。结果 (1)通过划痕标记荧光染料示踪技术检测结果表明细菌与细胞之比为50∶1作用24h时,减弱了胃黏膜上皮细胞株-GES-1细胞间隙连接通讯功能(P<0.05);(2)通过划痕标记荧光染料示踪技术检测结果表明头花蓼(64μg/mL)作用24h改善了幽门螺旋杆菌相关性胃炎细胞模型的细胞连接通讯功能(P<0.05)。结论头花蓼(64μg/mL)作用24h改善了幽门螺旋杆菌相关性胃炎细胞模型的细胞连接通讯功能,为头花蓼对H.pylori相关性胃炎的抗菌、抗炎机制奠定了实验基础。

鱼藤酮对星形胶质细胞缝隙连接耦联功能的影响

目的观察鱼藤酮对星形胶质细胞缝隙连接耦联功能的影响。方法建立星形胶质细胞与常用的神经细胞株PC12细胞共培养鱼藤酮染毒模型,应用划痕染料标记示踪技术观察染毒星形胶质细胞缝隙连接耦联功能的变化,采用RT-PCR法检测CX43 mRNA的表达,Western Blot技术观察CX43蛋白活性变化。结果随着染毒剂量的增加,鱼藤酮对星形胶质细胞缝隙连接耦联功能的抑制作用愈发明显;与正常对照组比较,0.5、1.0μmol/L鱼藤酮染毒组CX43 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01)。结论鱼藤酮可引起星形胶质细胞CX43表达水平降低,显著抑制细胞缝隙连接耦联功能,这可能是其诱导神经细胞损伤的原因之一。