刚地弓形虫RH株对小鼠胎盘滋养细胞凋亡的影响

目的通过研究刚地弓形虫强毒株RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞凋亡的影响,初步探讨不同毒力虫株引起病理妊娠的机制。方法将小鼠胎盘滋养层细胞分别接种于不同细胞培养瓶,对照组加入DMEM培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×106/ml、4×106/ml、8×106/ml)弓形虫速殖子培养2、4、8h,Annexin-V-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率变化;荧光显微镜观察细胞形态改变情况;Western blot分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达或活性。结果流式细胞仪检测弓形虫感染后的滋养层细胞凋亡率较对照组有下降趋势(P<0.05),呈量效依赖性,弓形虫数量8×106/ml实验组8h凋亡率最低,为(15.81±0.19)%;荧光显微镜观察到8h不同数量实验组滋养细胞凋亡形态改变情况,各组均有典型的早期凋亡细胞:细胞膜着绿色,细胞核拒染。随着弓形虫感染数量增加,凋亡细胞数目有所减少。Western blot检测刚地弓形虫RH株作用于滋养层细胞8h后实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达较对照组分别有明显的降低与升高(P<0.05)。结论刚地弓形虫RH株可抵抗体外培养的孕期小鼠滋养细胞正常凋亡,其机制可能与滋养细胞Bax表达下调和Bcl-2表达上调有关。

刚地弓形虫RH株感染对小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响

目的研究刚地弓形虫RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响及相关机制。方法制备小鼠胎盘滋养层细胞并分别接种于不同细胞培养皿,对照组加入DMEM高糖培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×104/mL、4×104/mL、8×104/mL)弓形虫速殖子培养6h、12h、24h;以MTT法检测滋养细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞周期;Western印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclinA、cdk2表达或活性。结果 MTT法检测结果显示刚地弓形虫RH株抑制滋养层细胞增殖,且呈时间剂量依赖性;流式细胞仪检测24h感染组细胞周期在S期产生阻滞,8×104/mL数量组S期细胞比例高达68.73%±1.76%;Western印迹方法分析感染弓形虫组滋养层细胞的cyclinA、cdk2蛋白表达量较对照组明显下降(P<0.05)。结论刚地弓形虫RH株能够抑制小鼠胎盘滋养层细胞增殖并通过调节cyclinA、cdk2等蛋白表达或活性改变引起细胞S期阻滞。

刚地弓形虫RH株感染对BALB/c小鼠情绪行为的影响

目的研究刚地弓形虫RH株感染对BALB／c小鼠学习记忆行为的影响及可能机制。方法将72只周龄、大小相近的雄性BALB／c小鼠采用随机数字表分为生理盐水对照组与不同数量（3×10^3／ml、3×10^4／ml、3×10^5／m1）弓形虫RH株感染组，每组18只。于感染第5周从每组各随机抽取6只分别进行高架十字迷宫实验、旷场实验及强迫游泳实验，观察各组小鼠在实验中情绪行为变化。并记录各项指标进行统计分析。结果在高架迷宫试验与旷场实验中，3×10^3／ml弓形虫感染组小鼠与生理盐水对照组小鼠比较，各项行为学指标无明显差异。在3×10^4／ml、3×10^5／ml弓形虫感染组小鼠与对照组小鼠比较出现明显降低（P〈0．05）．以3×10^5／ml感染组最为明显，其小鼠运动活力（0E＋cE）、进入开放臂次数比例（OE％）、开放臂停留时间比例（OT％）小鼠爬行总格数、中央格在总格数中比例分别为11．08±2．12、28．73±0．59％、25．62±2．33％、32．30±17．26、2．42±0．65％。在强迫游泳试验中，各弓形虫感染组小鼠游泳的静止时间均高于对照组小鼠（P〈0．05），3×10^5／ml感染组静止时间最长，达226．6±1．9S。结论刚地弓形虫RH株感染可引起小鼠情绪行为改变，具有焦虑抑郁倾向。

弓形虫主要表面抗原1核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫保护作用的研究

目的研究刚地弓形虫RH株主要表面抗原1(P30)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法根据弓形虫P30基因的DNA序列设计一对引物,,将PCR扩增到的P30基因克隆到真核表达载体pcDNA.3.1中。大量制备pcDNA3.1-P30和pcDNA3.1质粒DNA。将48只BALB/c小鼠随机分成4组,每组12只,空质粒对照组(A组)第0、2、4周经小鼠股四头肌注射100μgpcDNA3.1质粒DNA;重组P30抗原免疫组(B组)第0、2、4周每鼠经背部皮下多点注射50μgrP30+福氏完全佐剂;P30DNA疫苗免疫组(C组)第0、2、4周经小鼠股四头肌注射100μgpcD-NA3.1-P30质粒DNA;P30DNA疫苗和重组P30抗原联合免疫组(D组)第0、2周经小鼠股四头肌注射100μgpcDNA3.1-P30质粒DNA,第4周每鼠经背部皮下多点注射50μgrP30+福氏完全佐剂。末次免疫4周后每鼠用100个弓形虫速殖子经腹腔感染,观察小鼠存活时间。结果成功构建刚地弓形虫RH株P30DNA疫苗,动物保护性实验表明,虽然与对照组相比实验组小鼠的存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论pcDNA3.1-P30DNA疫苗具有弓形虫病候选DNA疫苗分子的潜力。

刚地弓形虫感染对小鼠外周血和脾淋巴细胞Crry和CD55表达的影响

目的探讨刚地弓形虫急性感染对小鼠外周血细胞和脾淋巴细胞表面补体调节蛋白Crry和CD55表达的影响。方法将30只雄性C57BL／6小鼠按完全随机分组法分为感染组（20只）和对照组（10只）。感染组小鼠每只腹腔注射1．0×10^4个RH株刚地弓形虫速殖子，对照组注射等量生理盐水。感染组依次于感染后2d和5d采集标本，同时对对照组取材。采用流式细胞仪检测小鼠外周血红细胞、白细胞及脾淋巴细胞Crry与CD55的表达情况。结果①感染后2d小鼠外周血红细胞Crry和CD55阳性表达率依次为（96．17±2．86）％和（65．23±4．99）％，对照组依次为（98．24±0．83）％和（68．57±5．31）％，组间差异均无有统计学意义；感染后5d，其红细胞Crry和CD55阳性率依次为（81．77±4．51）％、（51．72±8．29）％，对照组依次为（97．94±0．95）％、（70．57±6．44）％，感染组较对照组降低（t=7．786，t=4．433，P〈0．01）。②感染后2d，白细胞Crry和CD55阳性率依次为（96．74±3．76）％、（71．80±6．74）％，对照组依次为（97．25±1．16）％、（74．84±3．87）％，两组比较均无有统计学意义的差异；感染后5d，其阳性率依次为（93．46±4．38）％、（59．67±6．37）％，对照组依次为（97．47±1．56）ok、（75．10±4．58）％，感染组比对照组降低（t=2．585，t=4．792，P〈0．05，P〈0．01）。③感染后2d，脾淋巴细胞Crry和CD55阳性率依次为（97．74±1．55）％和（66．58±2．67）％，对照组依次为（98．20±1．19）％和（69．98±4．62）％，两组比较均无有统计学意义的差异；感染5d后，其阳性率依次为（94．71±3．59）％、（56．86±6．98）％，对照组依次为（98．24±1．63）％、（71．18±4．09）％，其中，感染组CD55阳性率较对照组降低（t=4．195，P〈0．01），而Crry阳性率较对照组无有统计学意义的差异。结论小鼠感染刚地弓形虫RH株后，不会立刻影响外周血和脾淋巴细胞补体调节蛋白Crry、CD55表达水平；随着病情发展，刚地弓形虫感染可导致机体免疫细胞补体调节蛋白的表达水平降低，但对不同免疫细胞各补体调节蛋白影响程度并不相同。

孕期弓形虫感染对小鼠胎盘补体调节蛋白表达水平的影响

目的通过检测弓形虫感染对C57BL／6孕鼠胎盘补体调节蛋白的表达水平，探索孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子免疫机制。方法将C57BL／6孕鼠随机分为感染组和正常对照组，每组12只，感染组每只孕鼠于孕8d腹腔注射200个弓形虫强毒株（RH株）速殖子，对照组于相应时间注射等量生理盐水。所有孕鼠均于孕14d无菌分离胚胎组织，观察胎鼠发育情况。采用实时荧光定量PCR检测胎盘补体调节蛋白Crry、GPI-DAF及CD59a的mRNA的表达水平；采用流式细胞术检测胎盘单细胞悬液中Crry、GPI．DAF阳性细胞率。结果弓形虫感染导致感染组死胎率显著升高（感染组死胎率为80．95％，对照组为4．41％），两组之间差异有统计学意义（P〈0．01）；弓形虫感染组及对照组Crry、GPI-DAF和CD59a的mRNA表达水平分别为0．786±0．199、0．594±0．096、0．880±0．179和0．550±0．077、0．221±0．074、0．591±0．075，3类补体调节蛋白感染组与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）；感染组和对照组Crry、GPI-DAF的阳性细胞百分率分别为（10．03±2．11）％、（2．95±1．04l％和（3．15±1．32）％、（0．66±0．26）％，两类补体调节蛋白感染组与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论弓形虫感染导致孕鼠胎盘3种补体调节蛋白Crry、GPI—DAF及CD59a表达水平均升高，打破了母胎界面维持正常妊娠所需的免疫微环境，这可能是孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子免疫棚制之一．