^(13)C示踪技术在利玛原甲藻中腹泻性贝毒合成研究的应用

选取具有显著产毒差异的利玛原甲藻(Prorocentrum lima)SHG株与2XS株为研究对象,以2-^(13)C-甘氨酸为示踪原料结合高分辨质谱方法,为腹泻性贝类毒素及其酯化态毒素合成与代谢途径的研究提供新方法和思路。结果表明,两株藻共发现16种腹泻性贝毒及其酯化态毒素成分。对照培养条件下SHG株(大田软海绵酸毒素含量为7.88 pg/cell,鳍藻毒素1含量为4.35 pg/cell)的产毒能力高于2XS株(大田软海绵酸毒素5.70pg/cell),而甘氨酸作为氮源培养条件可显著提高两株藻的产毒总量(P<0.05)。^(13)C-甘氨酸标记组与甘氨酸培养组单细胞产毒量无显著变化(P>0.05)。腹泻性贝毒被标记后其同位素异构体丰度发生变化,其中酯化态受^(13)C标记的影响程度更高,二级质谱图清晰表示出其碎片离子及脱水峰的标记情况。该方法直观阐明了甘氨酸可作为P.lima标记原料的产毒供体,并使用稳定同位素标记方法首次实现了酯化态的同步标记,有助于腹泻性贝毒生成机制的进一步研究。

利玛原甲藻产毒差异及影响因素研究进展

利玛原甲藻(Prorocentrum lima,P.lima)是全球广泛分布的有害赤潮藻类,也是腹泻性贝毒(Diarrhetic Shellfish Toxins,DSTs)的主要产生藻之一,其产生的DSTs给海洋环境、渔业及人类健康带来了严重的危害。研究发现,全球范围内不同P.lima藻株的产毒能力具有显著差异,多种环境因子如营养盐、盐度、光照等因素均会对P.lima的产毒能力产生影响,从而决定了不同区域贝类中DSTs的风险。本文比较分析了全球范围内P.lima的产毒差异,并重点解析了环境因子对其产毒能力的影响,对于全球范围内P.lima产毒能力差异及影响因素形成了较为系统的科学认知,对未来开展P.lima海洋生态学及食品安全研究具有重要的借鉴意义。

不同磷源及浓度对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究

探讨了不同磷源条件下利玛原甲藻的生长情况,分析了碱性磷酸酶在营养盐利用方面的作用,对不同营养盐条件下腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poison,DSP)的合成情况进行了比较和分析.结果显示,以NaH2PO4、β-甘油磷酸钠和ATP分别作为唯一磷源时,NaH2PO4组和ATP组最大生长速率(μmax)差异不大,β-甘油磷酸钠组稍低;ATP组最大生物量(X)明显高于NaH2PO4组和β-甘油磷酸钠组.实验浓度范围内,β-甘油磷酸钠组碱性磷酸酶活性均比较低,而ATP组活性较高.NaH2PO4组因其浓度的变化而有较大的差异.浓度>2μmol/L时,活性比较低,<2μmol/L时,活性明显增高.β-甘油磷酸钠组大田软海绵酸(okadaic acid,OA)总含量和单位藻细胞OA含量最高,NaH2PO4组次之,ATP组最低.这些结果表明,利玛原甲藻可吸收利用无机磷NaH2PO4和有机磷β-甘油磷酸钠及ATP.其中,NaH2PO4和ATP的营养价值基本等效,而β-甘油磷酸钠的营养价值较低.ATP较NaH2PO4和β-甘油磷酸钠更有利于维持利玛原甲藻的生长.利玛原甲藻可以直接利用β-甘油磷酸钠;而ATP则需要碱性磷酸酶水解后才能利用.利玛原甲藻毒素的合成与营养盐的形态有关,不同营养盐条件下DSP的合成不同.β-甘油磷酸钠为磷源时,DSP合成量最多.磷盐对DSP合成的影响与该磷盐条件下利玛原甲藻的生理状态有关.

不同氮源对利玛原甲藻(Prorocentrum lima)生长和产毒的影响

采用单因子实验,设置4个浓度梯度:12μmo·lL-1、25μmol·L-1、50μmo·lL-1和100μmol·L-1,研究了NaNO3、NH4Cl和尿素对利玛原甲藻(Prorocentrum lima)的生长、硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)活性以及腹泻性贝毒(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)产生的影响,对比分析了利玛原甲藻对3种不同氮源的利用特征.结果发现,以NaNO3、NH4Cl和尿素分别作为氮源时,利玛原甲藻最大生长速率(μmax)相差不大;NaNO3组和尿素组之间最大生物量(X)和硝酸还原酶活性也相近;NH4Cl组最大生物量(X)和硝酸还原酶活性明显低于NaNO3组和尿素组.平台期NaNO3组单位藻细胞OA含量明显高于NH4Cl组和尿素组,NH4Cl组和尿素组之间无显著性差异.这些结果表明,利玛原甲藻可以利用无机氮(NaNO3、NH4Cl)和有机氮盐尿素,利玛原甲藻中可能存在尿素酶;NaNO3和尿素比NH4Cl可能更有利于维持利玛原甲藻的生长;利玛原甲藻毒素的合成与营养盐的形态有关,其中NaNO3最有利于毒素的合成.

海洋底栖甲藻——利玛原甲藻(Prorocentrum lima)对三种赤潮藻的化感作用

为明确利玛原甲藻(Prorocentrum lima)对其它生物可能存在的化感作用,考察了利玛原甲藻培养物、无藻细胞滤液以及腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)粗提物对塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)、海洋卡盾藻(Chattonella marina)和东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)3种赤潮藻生长的影响.结果显示,共培养时利玛原甲藻对其它3种赤潮藻的生长有不同程度的抑制作用,其生长也受到3种赤潮藻的影响;无藻细胞滤液对东海原甲藻和海洋卡盾藻有抑制作用,其中对东海原甲藻的抑制作用更明显,但对塔玛亚历山大藻的影响不大;比较而言,DSP粗提物对3种藻的影响最为明显,甚至可完全抑制海洋卡盾藻的生长.这些结果提示,利玛原甲藻与赤潮藻间存在交互抑制作用,可能会通过分泌化感物质、细胞间接触抑制等途径抑制其它藻的生长;利玛原甲藻具有一定的化感作用,但DSP毒素并非利玛原甲藻发挥化感效应的主要原因.

利玛原甲藻形态特征及生活史的研究

利用光学显微镜和电子显微镜对利玛原甲藻(Procentrum lima)形态特征及生活史进行了观察。结果表明,其细胞呈卵圆形,长33～44μm,宽23～33μm,壳孔62～87个,边缘刺胞孔52～68个。同时,对其生活周期及生殖方式进行了追踪观察,不同的生活周期存在着不同的细胞形态。二分裂是利玛原甲藻主要的分裂方式,并首次发现利玛原甲藻疑似横分裂、出芽生殖的生殖方式。利玛原甲藻面对不良环境时会形成薄壁囊胞。

海洋底栖甲藻——利玛原甲藻(Prorocentrum lima)产毒特征的研究

为了解海洋底栖甲藻——利玛原甲藻(Prorocentrum lima)的产毒特征,阐明腹泻性贝毒(Diarrhetic shellfishpoisoning,DSP)复杂的生物合成机制,采用酶联免疫试剂盒,对利玛原甲藻不同生长期、不同营养盐条件下毒素生成情况进行了研究.结果显示,不同生长期单个利玛原甲藻细胞中大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)的含量明显不同,平台期时OA含量最高,与对数中期存在显著差异(p<0.05).低N、P条件下藻的生长状况较差,所能到达的藻密度明显低于对照组(f/2培养基);藻细胞中OA的总含量也低于对照组,但单个藻细胞中OA的含量明显高于对照组(p<0.05).以上结果提示,利玛原甲藻DSP毒素的产生可能与藻所处的环境和藻的生理状态等有关.

光照周期、温度和起始密度对利玛原甲藻(三亚株)生长的影响

研究了光照周期、温度和起始密度3个因素的不同水平组合对利玛原甲藻Prorocentrum lima(三亚株)的生长的影响。结果显示,光照周期、温度和起始密度均是影响利玛原甲藻生长的显著因子(F>F0.01),影响程度为:起始密度>光照周期>温度,最佳搭配为温度30℃,光照周期12h:12h,起始密度2000cells·mL-1。

利玛原甲藻中聚酮合酶基因克隆与分析

为探讨聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因与藻毒素合成的关系,揭示PKS基因在赤潮毒素合成中的作用,采用兼并引物,通过PCR技术获得利玛原甲藻(Prorocentrum lima)可能存在的I型PKS基因;并对所获得PKS基因的同源性进行了分析,构建了基于PKS氨基酸序列的系统进化树;采用RT-PCR技术分析了PKS基因在利玛原甲藻中的表达状况;并通过多聚腺苷酸RNA的扩增、细菌的分离鉴定、限制性内切酶酶切、Southern blotting等技术对PKS基因进行了分析。结果表明,利玛原甲藻中PKS基因与海洋原甲藻聚为一支,在利玛原甲藻中有显著表达;以Oligo(T)引物进行RT-PCR扩增时,可出现18S rRNA和PKS基因相应条带;限制性内切酶酶切和Southern blotting结果显示,该基因中存在明显的甲基化;16S rRNA基因序列分析显示,从利玛原甲藻培养液中分离到的细菌与海洋放线菌假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)基因序列同源性达到99%,该菌株中并不存在PKS基因。结果显示,所获得的PKS基因是利玛原甲藻聚酮合酶基因,基因序列已提交GenBank(EF521601);PKS可能在腹泻性贝毒合成中起着关键作用。

SYBR Green实时荧光定量PCR检测利玛原甲藻的研究

建立应用SYBR Green实时荧光定量PCR技术快速定量检测利玛原甲藻的方法。结果表明,理论上,该方法对于4个利玛原甲藻细胞便可检测出,灵敏度较高;实际应用时检测出的细胞数为(505±14.72)cells/L(镜检为600 cells/L,误差为15.83%,符合海洋调查规范中浮游生物调查误差在20%以内的要求)。本检测方法具有快速、特异、准确等优点,可作为海洋环境监测中定性定量检测利玛原甲藻的方法。

温度、盐度和光照对一株有毒利玛原甲藻生长的影响研究

针对一株利玛原甲藻(Prorocentrum lima Dodge),应用小鼠生物测试法和高效液相色谱-质谱联用分析方法对其毒性和毒素成分进行了初步分析,并通过多因子实验,研究了温度、盐度和光照强度等环境因子对利玛原甲藻生长的影响。分析结果显示,这株利玛原甲藻能够产生大田软海绵酸(Okadaicacid,OA)和鳍藻毒素1(Dinophysistoxin 1,DTX1)等腹泻性贝毒(Diarrhetic Shellfish Poison,DSP)。多因素方差分析结果表明,在实验条件范围内(温度为18、21和24oC;盐度为28、32和36;光照强度为2500、5 000和7 500 lx),利玛原甲藻的生长受盐度影响显著(P<0.05),而温度和光照强度对利玛原甲藻的生长没有显著影响。温度和光照强度及温度和盐度之间的交互作用对利玛原甲藻的比增长率也有显著影响(P<0.05)。根据实验结果,这株利玛原甲藻生长的最适条件为:温度18oC,盐度28,光照强度7 500 lx。

利玛原甲藻PL11共附生菌多样性研究

为揭示产腹泻性贝类毒素(diarrheic shellfish poisoning,DSP)典型赤潮甲藻-利玛原甲藻(Prorocentrum lima)PL11的共附生菌群多样性信息,通过Illumina MiSeq高通量测序分析了PL11的共附生菌群种类及相对丰度,并且对其可培养共附生菌株进行了选择性分离及其16S rRNA基因序列扩增与系统发育的分析。利玛原甲藻PL11高通量测序结果显示:样品共附生细菌包括5门,14纲,26目,38科及54属。其中优势门(>5%)为3个,包括变形菌门(Proteobacteria,75.5%)、拟杆菌门(Bacteriodetes,11.5%)以及浮霉菌门(Planctomycetex,8.5%);优势纲(>5%)为4个,包括α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,51.7%)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria,31.8%)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria,9.9%)以及OM190纲(8.9%);优势属(>5%)为6个,侏囊菌科下未知属(norank Nannocystaceae,21.8%)、Pyruvatibacte属(11.6%)、Phaeodactylibacter属(9.4%)、生丝单胞菌科下未知属(norank Hyphomonadaceae,8.5%)、OM190纲下未知属(8.1%)以及Roseovarius属(7.9%)。从利玛原甲藻PL11培养物中分离获得可培养微生物菌株9株,分属于8个属,包括Ochrobactrum sp.(2株)及Microbacterium sp.、Algoriphagus sp.、Ponticoccus sp.、Hoeflea sp.、Labrenzia sp.、Sphingopyxis sp.、Erythrobacter sp.各1株。其中PL11-1为Ponticoccus属潜在新种。

利玛原甲藻对湛江港多种鱼虾贝的毒性研究

2010年3月采集在湛江港爆发的利玛原甲藻赤潮海水,测定了湛江港利玛原甲藻赤潮海水对凡纳滨对虾虾苗、斑节对虾虾苗、菲律宾蛤仔、丽文蛤和乌塘鳢的毒性。结果表明,利玛原甲藻对2种虾苗有一定的毒性影响,其中对凡纳滨对虾虾苗的96 h半致死浓度为1.990×106个/L,对斑节对虾虾苗的96 h半致死浓度为1.214×106个/L;利玛原甲藻毒物含量较低,因此赤潮海水对菲律宾蛤仔、丽文蛤和乌塘鳢未产生明显的毒性影响。

营养盐限制对利玛原甲藻生长和产毒的影响

通过设定氮限制(1/2N,1/4N,1/8N,1/16N,1/32N)和磷限制(1/2P,1/4P,1/8P,1/16P,1/32P),对1株来自三亚海域的热带利玛原甲藻(Prorocentrum lima)生长和产毒的影响进行研究。结果表明,低氮、磷水平严重限制P.lima生长,随着营养盐水平的降低,细胞产量、生长速率和单位体积叶绿素a含量等生长指标下降。对残留N、P营养盐检测分析的结果表明,N限制条件下,氮、磷残留量均很低(P<1μmol/L,N-NO_3^-<1.3μmol/L,N-NH_4^+<2.7μmol/L);P限制条件下,磷残留量低(<1μmol/L),N-NO_3^-残留量却随磷限制的增强而升高。P限制条件下,当NO_3^-与NH_4^+同时存在时,P.lima优先吸收NH_4^+。N、P限制对P.lima产毒影响显著,除了1/2P处理的冈田酸含量(13.02 pg/cell)与对照(13.18 pg/cell)几乎相等外,其余所有处理的冈田酸含量均有升高。冈田酸最高值出现在1/32P处理(42.16 pg/cell),稍高于N限制处理的最高值(1/32-N:41.30 pg/cell)。研究表明,单位细胞冈田酸含量与生长速率呈负相关。

光照强度对利玛原甲藻生长的影响

目的:研究不同光照强度对南海利玛原甲藻生长的影响。方法:设置了2 200 lx、3 000 lx、3 800 lx、4 600 lx 4个光照梯度,将指数期利玛原甲藻置于4个不同光照强度的条件下进行试验,测算细胞密度、生长速率,并运用SPSS软件对结果进行分析。结果:在设定的实验范围内,细胞终密度和平均生长速率均随着光照强度的减弱而增强,并且4组细胞终密度和平均生长速率之间均存在显著的差异(P<0.05)。结论:光照强度对利玛原甲藻生长影响显著。

有毒甲藻细胞密度测定方法的比较研究

采用显微镜计数法、荧光分光光度法、叶绿素a含量测定法、可见分光光度法对利玛原甲藻(Prorocentrum lima)指数生长期不同浓度的培养液进行细胞密度测定。结果表明,后3种细胞计数方法与显微镜计数法相比较,均有较好的线性关系;同时对不同生长期的利玛原甲藻培养液进行测定,结果表明,4种方法的生长曲线一致性良好。比较分析发现,可见分光光度法适用于不同细胞密度范围的测定,操作简单、耗时短、不需要破坏样品、适于批量操作,可确定为便捷、有效、可行的利玛原甲藻细胞计数法。

基于SSU rDNA和线粒体cox 1序列分析甲藻中不同生态类群的演化规律

应用SSU rDNA和线粒体cox 1序列研究甲藻(Dinoflagellate)中不同生态类群的演化关系。通过PCR扩增和测序获取4株甲藻SSU rDNA及其线粒体cox 1部分片段,结合GenBank中24株甲藻的相关序列,以Plasmodium falciparum为外群,构建ML树和NJ树,并采用自展支持度评估进化树分支结构,通过计算后验概率评估进化树整体结构,应用1sKH、SH、ELW和2sKH等方法评估两株ML树间的拓扑结构。结果显示,在由上述两序列构建的进化树上,底栖原甲藻均未与浮游原甲藻聚类,且前沟藻具有独特演化地位。表明联合选择SSU rDNA和线粒体cox 1序列构建的进化树在一定程度上能够反映出甲藻的演化规律。这为从基因层面深入探索甲藻中不同生态类群的演化关系初步奠定了基础。

光照对中肋骨条藻和利玛原甲藻生长的影响

采用不同波长的LED光源(白光、蓝光、绿光、红光、蓝红光、蓝绿光)在不同光合有效量子通量密度光照下,培养硅藻类的中肋骨条藻和甲藻类的利玛原甲藻,观测不同波长对这两类赤潮优势藻的生长作用。结果表明,在相同光照强度下,对于单色光,两种藻类在蓝光作用下生长最快。复合光照射下,两种藻均在蓝-红光作用下生长较快,并且两种藻类在复合光下的生长率均大于单色光作用下的生长率。此外,两种藻的单色光吸收系数与相应的生长率成正相关。上述结果表明,不同波长的光照射对赤潮藻生长有重要的影响。

环境因子对利玛原甲藻(Prorocentrum lima)产毒影响的初步研究

目的利玛原甲藻是产生腹泻性贝毒的主要甲藻之一。产毒藻株在不同培养条件下所产生的毒素总量有差异,研究环境因子对利玛原甲藻产毒的影响,对腹泻性贝毒的进一步研究具有十分重要的意义。本研究旨在找到利玛原甲藻产毒的适宜条件。方法选取温度、光照周期、起始密度三个因素进行三因素三水平的正交实验。结果经统计分析,温度是显著因子(F>F_(0.05)),影响程度为:温度>起始密度>光照周期。结论利玛原甲藻产毒最佳条件是温度20℃,光照周期8 L:16D,起始密度6000 cells·mL^(-1)。

缘管浒苔对利玛原甲藻生长的克生作用

研究了缘管浒苔(Ulva linza)新鲜组织、干粉末、培养水过滤液和抽提液对利玛原甲藻(Prorocentrum lima)生长的克生效应。试验结果表明,缘管浒苔新鲜组织和干粉末对利玛原甲藻均有强烈的克生作用。利玛原甲藻以半连续培养法在缘管浒苔培养水过滤液中的生长受到明显抑制;以一次性培养法在缘管浒苔培养水过滤液中的生长未受到明显抑制;而煮沸的培养水过滤液对利玛原甲藻的生长无抑制作用。这表明,克生效应的产生需要克生物质的连续分泌,且克生物质在高温中易被分解。抽提液的克生作用表现为:甲醇抽提液大于水溶性抽提液大于氯仿抽提液,这表明缘管浒苔组织内的生长抑制活性物质具有相对较高的极性。