复合诱变和抗性筛选利迪链菌素高产菌株

为解决利迪链霉菌生产能力低的问题,以Streptomyces lydicus AS4.2501-P28为出发菌株,应用紫外和吖啶橙诱变,结合抗生素的抗性筛选,得到稳定高产的S.lydicus AS4.2501-L8,发酵水平达到177.0μg/mL,较出发菌株提高了96.2%。

响应曲面法优化利迪链霉菌A02发酵培养基

为了提高纳他霉素新产生菌利迪链霉菌Streptomyces lydicus A02的发酵水平,采用部分因子法、最陡爬坡试验和中心组合试验相结合的方法对该菌株的发酵培养基进行了优化。试验结果表明,培养基中的玉米淀粉、棉籽精粉和葡萄糖是影响纳他霉素产量的主要因子,由所得响应曲面方程预测出这3个主要因子的质量浓度分别为52.7,31.7和11.7g?L-1时,纳他霉素产量达最大值1735.3mg?L-1;经摇瓶和30L发酵罐试验验证,该理论预测值与实测值无显著差异;优化后培养基的产能较基础发酵培养基提高了32.9%～34.8%。据此认为,响应面法对利迪链霉菌产纳他霉素发酵培养基的优化具有实效性,本研究为其高产发酵工艺的建立奠定了基础。

利迪链霉菌A02的抑菌谱及其抑菌活性的稳定性

离体抑菌试验表明,利迪链霉菌A02对植物病原真菌具有广谱的抑制活性,不同病原菌种类对其敏感性有一定的差异,果蔬灰霉病菌、番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌和小麦纹枯病菌的敏感性较高;无菌发酵滤液稳定性测定显示,A02抑菌活性物质具有很好的热稳定性和耐酸碱、抗日光照射的特性,在70℃以下、pH5～8的条件下能较好地保持其抑菌活性。研究结果表明,拮抗菌A02在植物真菌性病害,尤其是半知菌引起的病害的生物防治中具有较高的应用价值。

利迪链霉菌A01活性代谢产物对甘蓝枯萎病菌的抑制作用及其机理

【目的】明确生防利迪链霉菌A01菌株的活性代谢产物纳他霉素对甘蓝枯萎病菌的抑制作用及其机理,为其下一步的产品开发和应用提供科学依据。【方法】分别采用带毒平皿法和凹玻片法测定活性产物对病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,采用电导率法和美蓝染色法分别测定其对菌丝体细胞膜通透性和细胞存活性的影响,借助电镜观察其对菌丝超微形态和结构的影响。【结果】纳他霉素对甘蓝枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发的最低抑菌浓度分别小于或等于31.92和41.04μg.mL-1,抑制中浓度分别为8.69和3.06μg.mL-1;30μg.mL-1以上浓度的纳他霉素处理90 min后可使菌丝悬浮液电导率明显升高,其作用强度与纳他霉素的浓度和作用时间呈正相关;处理后的菌丝生长异常或畸形,并出现细胞器解体、细胞液泡化等现象;10μg.mL-1以上纳他霉素处理120 min后菌丝大部分可被美蓝染成蓝色。【结论】纳他霉素对甘蓝枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发均有明显的抑制作用,能够增加病菌细胞膜的通透性,破坏菌丝细胞的形态和结构,导致其丧失存活能力。

利迪链霉菌A02诱导番茄抗灰霉病作用机制研究——对植株防御酶系的影响

利用利迪链霉菌生防菌株A02发酵液和番茄灰霉病菌对番茄植株进行诱导和接种处理，利用分光光度法测定处理前和处理后1，5d番茄叶片组织的主要防御酶系——苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性变化。试验结果显示，不接种灰霉病菌而单独诱导处理、接种灰霉病菌后诱导处理和诱导处理后接种灰霉病菌这3种处理都能提高番茄植株各防御酶系的活性，后者酶活性峰值最高，对番茄植株灰霉病的抑制作用也最明显，控制效果达94．92％。

利迪链霉菌A02诱导番茄抗灰霉病作用机理研究——对植株两种PR蛋白和总酚的影响

为了研究新型链霉菌生防菌株A02诱导番茄抗灰霉病的作用机制,利用利迪链霉菌A02的发酵液和番茄灰霉病菌,对番茄植株进行诱导和接种处理,采用分光光度法,测定处理前和处理后1-5 d番茄叶片组织中2种PR蛋白(几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)和总酚含量的变化。试验结果显示,不接种灰霉病菌而单独诱导处理、接种灰霉病菌后诱导处理和诱导处理后接种灰霉病菌这3种处理,都能显著地提高番茄植株几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性,且能提高总酚的相对含量,其中诱导处理中,酶活性和总酚相对含量提高的较为明显,酶活性峰值和总酚相对含量峰值都较高。通过试验,初步证明了利迪链霉菌A02发酵液诱发了番茄体内2种防御酶活性的提高和酚类物质的积累,增强了番茄植株抗灰霉病的防御体系。

代谢物组分析利迪链菌素生物合成代谢转变

为进一步明确利迪链菌素生物合成时从初级代谢到次级代谢的转变,运用ESI-MS和PCA分析,对利迪链霉菌AS 4.2501生产利迪链菌素不同发酵阶段的细胞内外代谢物进行代谢物组研究。结果表明,利用代谢物组学的方法能区分开不同发酵阶段的代谢产物,特别是根据第三主成分(PC3)可明显将细胞进入次级代谢与初级代谢阶段区分开,结合文献和MS/MS分析,推断代谢转变过程的生物标志物主要源于磷脂和蛋白类化合物。

利迪链霉菌G117产纳他霉素发酵培养基的优化

纳他霉素对甘蓝枯萎病菌、番茄和甜椒灰霉病菌等多种植物病原真菌有显著的抑制作用,且具有安全、高效、环保等特点,有望作为一种新型生物农药。为了提高利迪链霉菌G117生产纳他霉素的产量,依次使用PlackettBurman设计法、最陡爬坡法和Box-Behnken Design对其发酵培养基进行优化。应用Plackett-Burman设计法筛选出影响纳他霉素产量的3个关键因素为玉米淀粉、豆粕粉、氯化钠。通过Box-Behnken Design及响应面分析确定了3个关键因素的最佳浓度,分别为玉米淀粉46.15 g/L、豆粕粉14.80 g/L、氯化钠5.88 g/L,纳他霉素预测最大产量为2 708.06mg/L。利用优化后的发酵培养基进行3次平行实验,得到纳他霉素的平均产量为2 718.57 mg/L,与理论预测值无显著差异,比基础培养基产量提高了33.2%。为建立利迪链霉菌的纳他霉素高产发酵工艺奠定了基础。

利迪链霉菌E12发酵液及其粗提物的抑菌活性初探

利迪链霉菌E12的发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制活性。采用琼脂稀释法考察了淀粉和葡萄糖对利迪链霉菌发酵液抑菌活性的影响;采用大孔树脂吸附层析和浓缩沉淀提取发酵液中的抑菌活性物质;利用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)与含β-1,3-葡聚糖的琼脂糖凝胶直接反应测定粗提物的分子质量及β-1,3-葡聚糖酶活性并采用琼脂扩散法测定其抑菌活性。结果表明:当以淀粉作为惟一碳源时发酵液的抑菌率为89.2%,当以葡萄糖作为惟一碳源时发酵液无抑菌活性;在SDS-PAGE上仅出现1条大小为3 k Da左右的条带,且该条带具有抑菌活性,与其位置对应的琼脂糖凝胶上出现透明带。以上结果表明,利迪链霉菌E12可能产生一种具有β-1,3-葡聚糖酶活性的抑菌活性物质。

HIV蛋白酶抑制剂——利迪链菌素的分子对接研究

用分子对接的方法,对利迪链菌素的抗HIV蛋白酶活性进行了研究.为了更准确地反映利迪链菌素分子与酶蛋白结合的情况,充分考虑受体活性部位的柔性,采用了FlexX(初步对接)和Flexidock(精确对接)分两步将配体与受体进行对接.在初步对接中,设计了不同的受体活性部位来考察是否有结合水分子参与抑制剂与酶的结合.对一种作用方式已知的非肽类HIV蛋白酶抑制剂Aha006进行的对接研究显示,分子模拟的结果与实际情况吻合得较好,证明了本文所采用的方法的可靠性.利迪链菌素与蛋白酶活性部位的对接结果显示,配体分子与受体之间的结合没有结合水分子的参与,两者通过5对氢键作用结合成为稳定的复合物.利迪链菌素占据结合腔,覆盖了蛋白酶的活性三联体Asp25-Thr26-Gly27,从而起到抑制其生物活性的作用.

利迪链霉菌转运蛋白基因片段的克隆

转运蛋白在调控基因的作用下,完成将包括大分子量蛋白在内的多种物质跨膜转运的过程,在细胞的生理过程中起到重要的作用。将获得的利迪链霉菌的转运蛋白基因与其他放线菌的转运蛋白基因进行了同源性分析,探讨了基因的进化关系。

明欣利迪预防尖锐湿疣复发的疗效观察

目的探讨CO2激光术后外用明欣利迪预防尖锐湿疣复发的情况。方法治疗组采用CO2激光术后外用明欣利迪治疗12周,对照组单用CO2激光治疗。随访5个月,对两组的复发情况进行比较。结果治疗组复发率低于对照组,两组复发率比较差异有显著性(P<0.05)。结论明欣利迪外用可以降低尖锐湿疣的复发率。

将怪诞进行到底 以欧里庇得斯·拉斯卡利迪斯《泰坦众神》为例

时隔数年,由上海话剧艺术中心组织承办的ACT上海当代戏剧节隆重返场,在期待已久的观众群中引起一片欢欣。浏览演出剧目,赫然发现希腊新锐导演欧里庇得斯·拉斯卡利迪斯(Euripides Laskaridis)的《泰坦众神》(TITANS),欣悦之余又添了几分惊喜。国内大部分观众不仅没有看过拉斯卡利迪斯的作品,恐怕也鲜有人听说过这个名字。

利迪链霉菌A02抗真菌活性产物的分离和结构鉴定

利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物病原真菌高效拮抗菌株。为了明确其抑菌活性的物质基础,利用大孔树脂和硅胶吸附柱层析、HPLC循环制备分离等方法,从菌株A02发酵液中分离获得了纯度达99.845%以上的单一组分活性化合物。经紫外光谱、高分辨质谱、红外光谱和核磁共振谱的测定和解析,确定了该活性化合物的分子量为665,分子式为C33H47NO13,化学结构与四烯大环内酯类抗生素纳他霉素相同。这一结果揭示了利迪链霉菌产生抗真菌天然产物的新功能,并为纳他霉素在植物病害生物防治中的应用开拓了新的途径。

不同荧光蛋白基因标记利迪链霉菌

利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A01是一株分离自北京郊区对植物病原真菌具有广谱抑制作用的放线菌,在植物真菌病害防治中具有良好的应用前景。为了检测红霉素启动子在利迪链霉菌A01中的活性,为后期对菌株A01进行遗传改造提供技术支持,同时对生防菌A01进行遗传标记以研究和阐明其在生态环境中的生物学行为规律,本实验采用两亲本接合的方法,将增强绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)基因片段克隆到携带红霉素启动子(ermE*)的链霉菌表达载体pIB139中,成功构建了以egfp和rfp为报告基因的重组载体pIB139-EGFP和pIB139-RFP,并转化利迪链霉菌A01,突变株在荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光和红色荧光,同时PCR鉴定结果正确。这表明重组载体pIB139-EGFP和pIB139-RFP成功转入菌株A01,并且ermE*启动子成功启动egfp和rfp基因表达。

利迪链霉菌A02细菌人工染色体基因组文库的构建

利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物真菌病害高效生防菌，其活性产物为安全高效广谱的抗真菌剂纳他霉素。为了克隆纳他霉素生物合成基因簇和调控其表达相关的功能基因。通过基因改良的方式进行A02的定向分子改造，提高纳他霉素的效价和产量。提取了利迪链霉菌A02的基因组DNA，用HindⅢ和BamHI部分酶解后，回收了97-194kb和48．5-97kb大小的高分子量DNA。与质粒载体Copycontrol pCClBAC连接，分别构建了含有800个和1500个克隆的两个BAC文库。从文库中随机挑选20个克隆。酶切检测平均插入片段分别为133kb和65kb，空载率小于1％，假定利迪链霉菌的基因组有8×10^6kb，计算文库基因组覆盖率分别为12.28倍和11.25倍。因此。从文库筛选到目标片段的概率达99．99％以上。

利迪链霉菌A02产纳他霉素补料分批发酵参数的优化

为建立利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A02生产纳他霉素的高产发酵工艺，对其补料分批发酵的主要参数进行了优化。利用pH值实时监控自动补料摇床辅助优化，筛选出利迪链霉菌A02产纳他霉素的适宜pH值范围，以此为控制点进行30L自动发酵罐补料分批发酵实验，通过分析软件发酵之星（Biostar）5．0检测分析主要发酵参数动态趋势曲线与纳他霉素产量的相关性。结果显示，菌株A02最适于纳他霉素生物合成的发酵过程多参数优化组合为：培养温度30℃，pH值控制在6．25-6．29范围内。溶氧（DO）为20％。30％，摄氧率（OUR）和CO2释放率（CER）分别为25～15mmol／（L-h）和20-12mmol／（L·h），氨基氮含量0．20～0．23g／L。还原糖保持1．5％左右，至88h后自然下降，至112h为0．32％；此时纳他霉素质量浓度达最高值，发酵上清液中为2．02g／L，发酵液中为6．98g／L，较不控制pH值的对照分别提高28．66％和69．83％，为较好的发酵终点。通过优化调控主要发酵参数有效提高了利迪链霉菌A02生产纳他霉素的发酵水平。

利迪链霉菌K2对灰霉病菌的抑菌效果及抑菌物质鉴定

灰霉病是多种经济作物生产过程以及果蔬储藏运输中常见的病害,链霉菌能产生丰富的次级代谢产物,对灰霉病菌具有较好的抑制效果。【目的】筛选出更高效、功能更多的链霉菌,为针对灰霉病的生防菌剂的研发提供优良菌种。【方法】采用管碟法对菌株K2进行液体培养基的筛选及培养液活性的测定;双皿对峙等2种方法进行产挥发性物质对灰霉病菌的抑菌活性测定;通过16S rRNA基因序列分析进行菌株K2鉴定;高效液相色谱及液相色谱-质谱2种方法对培养液活性成分进行定性验证;顶空固相微萃取-气质联用对菌株K2产生的挥发性物质成分进行检测及鉴定。【结果】菌株K2在液体培养基A中产生的次级代谢物对苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、核盘菌、杨树溃疡病菌和烟草赤星病菌等多种植物病原真菌均具有较强的抑制作用;K2产生的挥发性物质对灰霉病菌的抑制率达100%,且抑制效果与挥发性物质的量有关;菌株K2与利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)亲缘关系非常接近,相似性为99%;培养液活性成分中含有谷氏菌素、丰加霉素和纳他霉素;在挥发性物质成分中发现了烯类、醇类、酯类及烷烃类等30种挥发性物质,其中含量较多的物质分别是2-methylisoborneol、1-undecene、p-menth-8-ene和3-methylene,同时还检测到已报道的2种抑菌物质benzothiazole和β-pinene。【结论】经鉴定K2菌株为利迪链霉菌,培养液具有广谱抑菌活性,其产生的挥发性物质对灰霉病菌也有较好的抑制效果,可作为优质生防菌种用于开发防治果蔬生产中灰霉病的生物农药。

利迪链霉菌M01对番茄生长、青枯病发病率及根际细菌群落组成的影响

【背景】利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)对多种作物均有较好的促生效果,且对病原真菌具有广谱抑制作用,但该菌对细菌性青枯病的防控研究较少。【目的】探究利迪链霉菌M01能否促进番茄生长并抑制番茄青枯病,以及M01对番茄生长的影响是否通过影响根际细菌群落结构实现。【方法】采用温室盆栽试验和扩增子高通量测序技术研究M01对番茄生长、青枯病发病率及根际细菌群落组成的影响。【结果】施用利迪链霉菌M01的番茄植株鲜重、干重、株高、用土壤与作物分析开发(soil and plant analyzer develotrnent,SPAD)方法测量的叶绿素浓度、根系活力和植株P含量比对照分别提高了22.7%、12.5%、16.0%、28.1%、18.4%和17.9%,其中对株高、SPAD值和植株磷含量影响显著(P<0.05)。M01处理延缓了番茄青枯病的发病时间,接种9周后发病率比对照降低了41.8%。此外,M01对番茄根际细菌群落无显著影响(门水平群落组成,P=0.4;属水平群落组成,P=0.4)。【结论】利迪链霉菌M01可促进番茄植株生长并抑制番茄青枯病,利迪链霉菌M01对番茄生长的影响并非通过调控根际细菌群落实现。

利迪链霉菌nsdA基因的克隆及其阻断载体的构建

[目的]构建nsdA基因的敲除载体和表达载体,获得阳性转化子。[方法]根据GenBank中报道的天蓝色链霉菌nsdA基因序列设计引物,在利迪链霉菌产纳他霉素菌株A01、A02和G117中扩增到预期目的片段,进一步克隆nsdA基因全长序列;经BLAST比对,其核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与天蓝色链霉菌均有较高同源性,据此判断利迪链霉菌A01、A02、G117中含有nsdA基因;进一步构建nsdA基因的敲除载体pLM103和表达载体pIBN139,转入大肠杆菌ET12567(puz8002)。[结果]nsdA基因全长序列1 407 bp,编码468个氨基酸,构建了nsdA基因的敲除载体pLM103和表达载体pIBN139。[结论]成功构建nsdA基因的敲除载体pLM103和表达载体pIBN139,并获得阳性转化子,为后续构建利迪链霉菌nsdA基因阻断突变株,以进一步探究nsdA基因在利迪链霉菌纳他霉素生物合成中的调控作用奠定了基础。