仔猪小肠上皮细胞刷状缘膜囊制备方法的研究

采用CaCl2 和MgCl2 两种沉淀法制备了断奶仔猪小肠上皮细胞刷状缘膜囊 (BBMV) ,并通过测定BBMV制备过程中的细胞膜或细胞器标志酶酶活、核糖核酸和脱氧核糖核酸含量等指标对所制备的BBMV的纯度进行了评价。结果表明采用MgCl2 沉淀方法制备的断奶仔猪小肠BBMV纯度优于CaCl2 沉淀法。

HPLC法测定仔猪小肠刷状缘膜囊孵育体系中的二肽含量

用高效液相色谱法测定了经仔猪小肠刷状缘膜囊水解后的甘 - L-脯、L-亮 -甘和 β-丙 -组共 3种二肽的剩余含量。分别以水 -三氟乙酸 (质量浓度分别为 0 .1 % ,0 .0 8%和 0 .1 % ,p H值分别为 2 .2 0 ,2 .30和 2 .2 0 )和乙腈 -三氟乙酸 (三氟乙酸质量浓度 0 .1 % )为流动相 ,经 Phenomennex ODS分析柱 (2 50 mm× 4.60 mm,5μm,C1 8)分离 ,在 2 0 0～ 40 0 nm处检测。结果表明 ,3种二肽在 0～ 30 0 μg.m L-1之间 ,其峰面积 (X)对质量浓度 (Y,μg.m L-1 )回归得方程分别为 Y=0 .0 0 0 1 X- 5.6945,(R2 =0 .9946) ;Y=0 .0 0 0 4 X- 1 .41 6 7,(R2 =0 .9999) ;Y=0 .1 842 X- 7.365 4,(R2 =0 .9948)。平均回收率依次为 1 0 0 .0 0 % ,1 0 0 .0 1 %和 99.92 % ,保留时间依次为 7.63,8.0 1和 4.1 7min,最大吸收波长依次为 2 0 1 ,2 0 0和 2 80 nm。该方法快速、简便和准确 ,结果稳定 ,重现性好 。

断奶仔猪小肠刷状缘膜囊中小肽水解的研究

通过孵育试验研究了L 亮 甘 (Leu Gly)和 β 丙 组 (Ala His)等两种二肽在断奶仔猪小肠刷状缘膜囊 (BrushBorderMembraneVesicles,BBMV)中的水解状况。结果表明 ,孵育液pH(分别为 3.5 ,4 .0 ,4 .5 ,5 .0 ,5 .5 ,6 .0 ,6 .5 ,7.0 ,7.5和 8.0 )、孵育温度 (2 5℃和 37℃ )、孵育时间 (0 .5 ,1,2 ,5 ,10 ,2 0 ,30和 4 0min)以及BBMV(可能含二肽酶 )的添加量对两种二肽在断奶仔猪小肠BBMV孵育体系中浓度没有影响。结果表明 ,Leu Gly和Ala

二肽在断奶仔猪小肠刷状缘膜囊中水解状况的研究

通过孵育试验研究了甘- L- 亮(Gly -Leu)和- L- 组 L- 亮(His- Leu) 2 种二肽在断奶仔猪小肠刷状缘膜囊(Brush Border Memlorane Vesides,BBMV)中的水解状况。结果表明,孵育液 pH值(分别为 3.5、4.0、4.5、5.0、5 5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、孵育温度(25 ℃和 37 ℃)、孵育时间(0 5、1、2、5、10、20、30 和 40 min)以及 BBMV(二肽酶)的添加量均不影响此 2 种二肽在断奶仔猪小肠 BBMV孵育体系中的水解。结果提示,Gly- Leu和 His- Leu 2种二肽在断奶仔猪小肠BBMV体系中均不水解。

厚颌鲂幼鱼肠上皮细胞刷状缘膜囊的提取

根据沉淀方法和离心速度的不同分为4个试验组提取厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)70日龄幼鱼的肠上皮细胞刷状缘膜囊(BBMV)。四个试验组如下:A组-钙离子沉淀法,28 000 g离心;B组-钙离子沉淀法,43000 g离心;C组-PEG沉淀法,28 000 g离心;D组-PEG沉淀法,43 000 g离心。采用细胞器和细胞膜指示酶的富集系数、核糖核酸和脱氧核糖核酸含量来评价各试验组提取BBMV的纯度。结果表明:肠上皮细胞刷状缘膜囊提取后,DNA的富集系数各组排列为D<B<C<A,D组的富集系数为0;RNA的富集系数排列为D<B<C<A,D组的富集系数为0.007;各组的蔗糖酶、γ谷氨酰转移酶(γ-GT)及碱性磷酸酶(AKP)富集系数排列为A<C<B<D,D组各酶的富集系数分别为:6.172、12.700、20.185。麦芽糖酶的富集系数排列为A<C<D<B,B组的富集系数为5.789;而Na+-K+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶(SDH)在采用43 000 g离心后均为0。上述结果说明采用PEG沉淀法、43 000 g离心试验组提取的BBMV的纯度优于其余各试验组。

甘-L-脯二肽在仔猪小肠刷状缘膜囊中的抗水解研究

通过孵育试验研究了甘-L-脯(Gly-Pro)二肽在断奶仔猪小肠刷状缘膜囊(Brush Border MemloraneVesides,BBMV)中的水解状况。结果表明,孵育液pH值(分别为3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5和8.0)、孵育温度(25℃和37℃)、孵育时间(0.5,1,2,5,10,20,30和40 min)以及BBMV的添加量均不影响此二肽在断奶仔猪小肠BBMV孵育体系中的水解。结果提示,Gly-Pro二肽在断奶仔猪小肠BBMV体系中不水解。

二肽在仔猪小肠刷状缘膜囊中跨膜转运的动力学特点研究

为研究二肽在仔猪小肠刷状缘膜囊(Brush border membrane vesicles,BBMV)中跨膜转运的动力学特点,采用同位素示踪及体外孵育技术,观察了几种不同条件下Gly-Pro的跨膜转运量。结果表明:(1)在有Na+和无Na+的条件下,Gly-Pro的转运均受到Leu-Gly、Ala-His、Gly-Leu和His-Leu等二肽的极显著抑制(P<0.01),但不受甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺和L-蛋氨酸的影响;(2)仔猪小肠BBMV对Gly-Pro的转运呈现非线性关系,但是遵从Michaelis-Menten动力学方程,其Kt(亲合常数)值为0.64 mmol/L,而Vmax为7.42 nmol/(min.mg)膜蛋白;(3)仔猪小肠BBMV对Gly-Pro的摄取是由于Gly-Pro直接进入BBMV内部的结果,而不是仅仅结合在BBMV上所引起的。结果提示,Gly-Pro在仔猪小肠BBMV中的跨膜转运具有载体介导的转运特点。

膜电位对仔猪小肠刷状缘膜囊中二肽跨膜转运的影响

为研究膜电位与仔猪小肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles,BBMV)中二肽跨膜转运之间的关系,采用膜电位诱导、体外孵育及同位素示踪技术,分别观察由缬氨霉素和羰基氰化物三氟甲氧基苯腙(carbonylcyanide p-(Tri-fluoromethoxy)phenylhydrazone,FCCP)诱导仔猪小肠BBMV产生的K+扩散电位(膜囊内负)和H+扩散电位(膜囊内正)对Gly-Pro二肽跨膜转运的影响。结果表明:在有Na+和无Na+的状况下,K+扩散电位均促进Gly-Pro二肽由膜囊外进入膜囊内部;H+扩散电位抑制Gly-Pro二肽由膜囊外进入膜囊内部。结果提示:在仔猪小肠BBMV转运体系中,Gly-Pro二肽的跨膜转运具有与非Na+的阳离子协同转运的特点。

钠离子对仔猪小肠刷状缘膜囊二肽跨膜转运的影响(英文)

为研究Na+在仔猪小肠Gly-Pro跨膜转运中的作用,采用同位素示踪及体外孵育技术,观察在不同Na+浓度梯度条件下Gly-Pro在仔猪小肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles,BBMV)的跨膜转运量。结果表明:(1)用K+替代Na+,并没有降低Gly-Pro在BBMV中的转运量,在孵育前20min时间内,Gly-Pro的转运量稍稍提高;(2)Na+可使BBMV对L-丙氨酸的转运量提高到4.6倍,但不影响Gly-Pro的转运;二氢骆驼蓬碱显著地降低L-丙氨酸的转运,但对Gly-Pro的转运无影响。研究提示,Gly-Pro在仔猪小肠BBMV体系中的转运与Na+不存在依赖性的关系。

Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合特性

【目的】营养期杀虫蛋白Vip3A是一种由苏云金芽孢杆菌在对数生长期产生的新型杀虫毒素。Vip3A与敏感昆虫中肠上皮细胞的结合是其发挥杀虫活性的关键步骤。为进一步探究Vip3A毒素的杀虫机理,研究Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡(BBMVs)的结合特性。【方法】在大肠杆菌中用IPTG诱导表达Vip3Aa10,用亲和层析和离子交换层析的方法纯化蛋白,并用胰蛋白酶活化Vip3Aa10,得到Vip3Aa10-T。然后分析Vip3Aa10前毒素和Vip3Aa10-T对甜菜夜蛾的杀虫活性,用免疫印迹法和配体印迹法分析Vip3Aa10-T与甜菜夜蛾BBMVs的结合特性以及在甜菜夜蛾BBMVs上的结合蛋白。【结果】Vip3Aa10-T与Vip3Aa10前毒素对甜菜夜蛾的杀虫活性很高。Vip3Aa10-T在pH8.0时更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合,并且能够与非敏感性昆虫黄粉虫BBMVs结合。在相同pH条件下,Vip3Aa10前毒素比Vip3Aa10-T更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合。Vip3Aa10-T在甜菜夜蛾BBMVs上有4条结合蛋白,其分子量分别为80、38、31和22kDa。【结论】活化的Vip3Aa10与甜菜夜蛾BBMVs的结合是pH依赖性的,并且能与BBMVs上的4个蛋白结合。

CrylA毒素与二化螟中肠刷状缘膜囊泡受体蛋白配基结合分析

分离和鉴定二化螟Chilo suppresalis幼虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)中Cryl A毒素的受体蛋白,对于阐明Cryl A毒素作用机理和二化螟抗性机理具有十分重要的意义。为此,本文就Cryl A毒素对二化螟杀虫活性及Cryl Ac与二化螟中肠受体的配基结合进行了研究。结果表明:Cryl Ab对二化螟室内品系(CN)的毒力高于Cryl Ac,而Cryl Ac高于Cryl Aa。配基结合分析表明二化螟CN品系幼虫中肠BBMV中有6个Cryl Ac结合蛋白(分子量分别为50,70,90, 120,160和180 kDa),其中180,160和90 kDa结合蛋白的条带颜色明显深于其他结合蛋白的条带,表明这3个受体蛋白具有较高的结合浓度。同源竞争结合研究表明,180和90 kDa结合蛋白为Cryl Ac的低亲合性结合蛋白,其他4个为高亲合性结合蛋白。为了研究Cryl Ac和Cryl Ab受体结合部位的相互作用,进行了异源竞争结合研究。Cryl Ab可以与Cryl Ac所有的6个结合蛋白进行竞争性结合,与180,120,70和50 kDa结合蛋白具有高亲合性,而与160和90 kDa结合蛋白具有低亲合性。结果显示,Cryl Ac与Cryl Ab在二化螟幼虫中肠BBMV上拥有多个共享的结合位点,但对每个结合位点的亲合性有差异。基于毒素结合部位的相似性,Cryl Ac和Cryl Ab不宜同时用于转基因Bt水稻来控制二化螟。

杠柳新苷类化合物对东方黏虫的杀虫活性及对中肠细胞刷状缘膜囊泡3种特征酶活性的影响

为了研究和阐明杠柳新苷类杀虫活性化合物对东方黏虫的杀虫活性及作用靶标,采用载毒叶片饲喂法测定比较了6个杠柳新苷类化合物(PSA、PSD、PSE、PSF、PSP和PST)对3龄东方黏虫Mythimna separata Walker幼虫的毒力;应用MgCl_(2)沉淀差速离心法制备东方黏虫中肠细胞刷状缘膜囊泡(BBMV)基础上,测定了6个化合物对东方黏虫幼虫中肠细胞BBMV中3种特征酶——氨肽酶、碱性磷酸酶及V-ATP酶活性的影响。结果表明:杠柳新苷P(PSP)和T(PST)对3龄东方黏虫幼虫表现出较高的杀虫活性,其24 h的致死中浓度(LC_(50)值)分别为1.60和1.23 mg/mL,杠柳新苷A(PSA)、D(PSD)和F(PSF)仅表现出微弱的杀虫活性(LC_(50)>20 mg/mL),而杠柳新苷E(PSE)则无明显杀虫活性。酶活性测定结果表明,6个杠柳新苷类化合物对氨肽酶和碱性磷酸酶活性均没有明显的抑制作用,而高杀虫活性化合物PSP和PST则可浓度依赖地抑制V-ATP酶活性。推测杠柳新苷类杀虫活性化合物的作用靶标与VATP酶有密切关系。

重度烧伤鼠肠上皮细胞及其刷状缘谷氨酰胺转运的变化

目的探讨烧伤后肠上皮细胞及其刷状缘谷氨酰胺（glutamine,Gln）转运变化规律。方法将40只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组（8只）、烧伤组（烧伤后1、3、5、7 d,每个时相点8只）。正常对照组只麻醉和剃毛,不予烧伤;烧伤组给予90℃水烫伤18 s,造成30%体表面积Ⅲ度烧伤。2组给予正常饮食及饮水。联合应用胶原酶Ⅸ和中性蛋白酶Ⅰ消化法提取大鼠小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC）,采用Mg^2＋差速离心法制备大鼠小肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles,BBMV）,检测进入BBMV及IEC中的[^3H]-Gln的放射性强度,观察伤前及烧伤后1、3、5、7 d大鼠肠道BBMV及IEC中Gln转运速率的变化。结果采用Mg^2＋差速离心法成功提取大鼠肠上皮BBMV。发现肠上皮细胞中Na＋依赖性Gln转运主要依靠BBMV,大约占总量的60%;烧伤第1天BBMV中Gln转运效率明显下降（P〈0.05,P〈0.01）,伤后3-7 d有所增高,但差异无统计学意义（P〉0.05）。IEC中Na^＋依赖性Gln转运变化不明显,而非Na＋依赖性Gln转运则有逐步增高的趋势,在伤后7 d明显高于对照组（P〈0.05）。结论肠上皮细胞对Gln的转运主要依靠BBMV中Na^＋依赖性转运,烧伤后BBMV转运Gln的能力先降低后增高,而IEC对非Na＋依赖性Gln转运则呈逐步增高的趋势。

仔鸡外翻肠囊适宜培养时间的研究

外翻肠囊法是在体外培养小肠肠环技术和刷状缘膜囊技术的基础上发展而来的，是指在动物麻醉无痛或屠宰状态下立即分离小肠，去掉肠系膜，用生理盐水或缓冲液冲洗干净，然后根据试验目的将所需肠段外翻使肠粘膜向外，结扎一端形成肠囊状，灌注人工培养液后结扎另一端，置于添加有被测物质的培养液中，通入O2或95％O2和5％CO2的混合气体，培养一定时间后，

内流质子梯度对Gly-Pro在仔猪小肠跨膜转运中的驱动作用

为研究内流质子梯度对仔猪小肠中Gly-Pro跨膜转运的影响,采用放射性同位素示踪及体外孵育技术,观察在不同H+浓度条件下,Gly-Pro在仔猪小肠刷状缘膜囊(Brush border membrane vesicles,BBMV)的跨膜转运量。结果表明:膜囊内液pH为7.5时,Gly-Pro的转运显著地受到膜囊外液pH值的影响,pH为4.5～5.5时,转运最快;其中pH为5.0时的Gly-Pro跨膜转运速度在1-20 min一直高于pH为7.5时的转运速度;内流质子梯度的存在可以显著促进Gly-Pro的转运,无内流质子梯度时,Gly-Pro的转运不受膜囊外液pH变化的影响。研究结果提示,跨膜内流质子梯度是仔猪小肠中Gly-Pro的跨膜转运的一种驱动力。

棉铃虫和甜菜夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶活性测定以及活化、降解Cry1Ac毒素分析

昆虫中肠对Bt原毒素活化与对活化毒素降解的变化被认为是害虫对Bt产生的机制之一,研究比较棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)与甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)的中肠液、BBMV蛋白酶的活性,通过SDS-PAGE分析2种昆虫对原毒素的活化速度与对活化毒素的降解速度。2种昆虫的中肠液蛋白酶活性均显著高于BBMV蛋白酶活性,中肠液与BBMV均能迅速活化原毒素并继续降解活化后的毒素,与中肠液相比,BBMV对原毒素的活化与对活化毒素的降解均慢于中肠液,甜菜夜蛾对毒素的活化与降解又慢于棉铃虫。另外,还测定抑制剂对中肠液蛋白酶活性的抑制作用,结果表明,各抑制剂对棉铃虫和甜菜夜蛾相应酶活性的抑制表现出相同的趋势,TLCK对丝氨酶蛋白酶具较好的抑制作用,而PMSF对胰蛋白酶的抑制作用次之,TPCK对胰凝乳蛋白酶的抑制作用较弱。

生长猪小肠钠依赖型磷摄入特性的研究

选取6头体重接近的3月龄生长期大白猪,屠宰后刮下肠黏膜,提取3段小肠上皮细胞刷状缘膜囊泡(Brush-border membrane vesicles,BBMV)。在室温条件下,研究各段小肠BBMV磷的摄入量,pH和钠离子依赖性,并测定BBMV磷吸收动力学参数。结果表明,生长猪BBMV对磷的主动吸收和被动扩散在酸性pH下均受到抑制。钠离子水平影响BBMV磷的主动吸收。pH7.4条件下,测得钠依赖型磷转运系统Hill系数(napp)为2.07,即转运1个磷酸根,至少有2个钠离子与其协同转运。不同肠段BBMV磷的主动吸收并没有显著差异。pH7.4条件下,生长猪钠依赖型磷转运系统对磷的亲和力常数(Km)为(0.43±0.09)mmol/L。最大转运速度(Vmax)为(2.25±0.19)nmol/(mg蛋白.15 s)。

棉铃虫幼虫中肠细胞脂筏的制备及鉴定

脂筏是细胞膜上富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇锚着蛋白的去垢剂不溶性微结构域,被认为是多种细胞膜孔毒素在细胞表面形成寡聚体的平台。为研究脂筏与Bt毒素在细胞膜上形成寡聚体膜孔的关系,本文对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠脂筏的制备与鉴定方法进行了研究。根据脂筏在低温(4℃)下不溶于去垢剂的特性,采用Triton X-100处理棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡,溶解非脂质筏成分,以OptiPrep为介质进行密度梯度离心,分离去垢剂不溶组分,成功地得到了棉铃虫幼虫中肠上皮细胞的脂筏。再以脂筏的特有化学成分神经节苷脂GM1作为脂筏的标志分子,利用霍乱毒素β亚基能与GM1特异性结合的特性,以辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素β亚基用点印迹法化学发光检测神经节苷脂的分布,从而对脂筏进行定性鉴定。结果表明我们建立的脂筏制备方法简便、易行,比传统的蔗糖梯度离心法大大缩短了制备所需时间。

高效液相色谱法评定二肽水解的研究

用高效液相色谱法测定了仔猪小肠刷状缘膜囊 (BrushBorderMembraneVesicles ,BBMV)孵育体系中甘 -L -亮 (Gly -Leu)和L -组 -L -亮 (His -Leu)等两种二肽的含量。分别以水 (pH值为 5 .5 5 )和乙腈 -三氟乙酸 (三氟乙酸浓度为 0 .1% )为流动相 ,经PhenomennexODS分析柱(2 5 0mm× 4 .6 0mm ,5 μm ,C18)分离 ,检测波长为 190～ 4 0 0nm。结果表明 ,两种二肽在 0～30 0 μgmL- 1的之间 ,其峰面积 (X)对质量浓度 (Y ,μgmL- 1)回归得方程分别Y =0 .0 0 0 1X +0 .8719,R2 =0 .9999和Y =0 .0 0 0 0 6X +6 .6 312 8,R2 =0 .9982 ;回收率依次为 99.91%和10 0 .0 5 % ,保留时间依次为 2 .0 7和 1.0 1min ;最大吸收波长依次为 197和 199nm。该方法快速、简便和准确 ,结果稳定 ,重现性好 ,可以用来评定该两种二肽在动物小肠BBMV体系中的水解状况。