Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合特性

【目的】营养期杀虫蛋白Vip3A是一种由苏云金芽孢杆菌在对数生长期产生的新型杀虫毒素。Vip3A与敏感昆虫中肠上皮细胞的结合是其发挥杀虫活性的关键步骤。为进一步探究Vip3A毒素的杀虫机理,研究Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡(BBMVs)的结合特性。【方法】在大肠杆菌中用IPTG诱导表达Vip3Aa10,用亲和层析和离子交换层析的方法纯化蛋白,并用胰蛋白酶活化Vip3Aa10,得到Vip3Aa10-T。然后分析Vip3Aa10前毒素和Vip3Aa10-T对甜菜夜蛾的杀虫活性,用免疫印迹法和配体印迹法分析Vip3Aa10-T与甜菜夜蛾BBMVs的结合特性以及在甜菜夜蛾BBMVs上的结合蛋白。【结果】Vip3Aa10-T与Vip3Aa10前毒素对甜菜夜蛾的杀虫活性很高。Vip3Aa10-T在pH8.0时更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合,并且能够与非敏感性昆虫黄粉虫BBMVs结合。在相同pH条件下,Vip3Aa10前毒素比Vip3Aa10-T更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合。Vip3Aa10-T在甜菜夜蛾BBMVs上有4条结合蛋白,其分子量分别为80、38、31和22kDa。【结论】活化的Vip3Aa10与甜菜夜蛾BBMVs的结合是pH依赖性的,并且能与BBMVs上的4个蛋白结合。

CrylA毒素与二化螟中肠刷状缘膜囊泡受体蛋白配基结合分析

分离和鉴定二化螟Chilo suppresalis幼虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)中Cryl A毒素的受体蛋白,对于阐明Cryl A毒素作用机理和二化螟抗性机理具有十分重要的意义。为此,本文就Cryl A毒素对二化螟杀虫活性及Cryl Ac与二化螟中肠受体的配基结合进行了研究。结果表明:Cryl Ab对二化螟室内品系(CN)的毒力高于Cryl Ac,而Cryl Ac高于Cryl Aa。配基结合分析表明二化螟CN品系幼虫中肠BBMV中有6个Cryl Ac结合蛋白(分子量分别为50,70,90, 120,160和180 kDa),其中180,160和90 kDa结合蛋白的条带颜色明显深于其他结合蛋白的条带,表明这3个受体蛋白具有较高的结合浓度。同源竞争结合研究表明,180和90 kDa结合蛋白为Cryl Ac的低亲合性结合蛋白,其他4个为高亲合性结合蛋白。为了研究Cryl Ac和Cryl Ab受体结合部位的相互作用,进行了异源竞争结合研究。Cryl Ab可以与Cryl Ac所有的6个结合蛋白进行竞争性结合,与180,120,70和50 kDa结合蛋白具有高亲合性,而与160和90 kDa结合蛋白具有低亲合性。结果显示,Cryl Ac与Cryl Ab在二化螟幼虫中肠BBMV上拥有多个共享的结合位点,但对每个结合位点的亲合性有差异。基于毒素结合部位的相似性,Cryl Ac和Cryl Ab不宜同时用于转基因Bt水稻来控制二化螟。

杠柳新苷类化合物对东方黏虫的杀虫活性及对中肠细胞刷状缘膜囊泡3种特征酶活性的影响

为了研究和阐明杠柳新苷类杀虫活性化合物对东方黏虫的杀虫活性及作用靶标,采用载毒叶片饲喂法测定比较了6个杠柳新苷类化合物(PSA、PSD、PSE、PSF、PSP和PST)对3龄东方黏虫Mythimna separata Walker幼虫的毒力;应用MgCl_(2)沉淀差速离心法制备东方黏虫中肠细胞刷状缘膜囊泡(BBMV)基础上,测定了6个化合物对东方黏虫幼虫中肠细胞BBMV中3种特征酶——氨肽酶、碱性磷酸酶及V-ATP酶活性的影响。结果表明:杠柳新苷P(PSP)和T(PST)对3龄东方黏虫幼虫表现出较高的杀虫活性,其24 h的致死中浓度(LC_(50)值)分别为1.60和1.23 mg/mL,杠柳新苷A(PSA)、D(PSD)和F(PSF)仅表现出微弱的杀虫活性(LC_(50)>20 mg/mL),而杠柳新苷E(PSE)则无明显杀虫活性。酶活性测定结果表明,6个杠柳新苷类化合物对氨肽酶和碱性磷酸酶活性均没有明显的抑制作用,而高杀虫活性化合物PSP和PST则可浓度依赖地抑制V-ATP酶活性。推测杠柳新苷类杀虫活性化合物的作用靶标与VATP酶有密切关系。

重度烧伤鼠肠上皮细胞及其刷状缘谷氨酰胺转运的变化

目的探讨烧伤后肠上皮细胞及其刷状缘谷氨酰胺（glutamine,Gln）转运变化规律。方法将40只Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组（8只）、烧伤组（烧伤后1、3、5、7 d,每个时相点8只）。正常对照组只麻醉和剃毛,不予烧伤;烧伤组给予90℃水烫伤18 s,造成30%体表面积Ⅲ度烧伤。2组给予正常饮食及饮水。联合应用胶原酶Ⅸ和中性蛋白酶Ⅰ消化法提取大鼠小肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IEC）,采用Mg^2＋差速离心法制备大鼠小肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles,BBMV）,检测进入BBMV及IEC中的[^3H]-Gln的放射性强度,观察伤前及烧伤后1、3、5、7 d大鼠肠道BBMV及IEC中Gln转运速率的变化。结果采用Mg^2＋差速离心法成功提取大鼠肠上皮BBMV。发现肠上皮细胞中Na＋依赖性Gln转运主要依靠BBMV,大约占总量的60%;烧伤第1天BBMV中Gln转运效率明显下降（P〈0.05,P〈0.01）,伤后3-7 d有所增高,但差异无统计学意义（P〉0.05）。IEC中Na^＋依赖性Gln转运变化不明显,而非Na＋依赖性Gln转运则有逐步增高的趋势,在伤后7 d明显高于对照组（P〈0.05）。结论肠上皮细胞对Gln的转运主要依靠BBMV中Na^＋依赖性转运,烧伤后BBMV转运Gln的能力先降低后增高,而IEC对非Na＋依赖性Gln转运则呈逐步增高的趋势。

棉铃虫和甜菜夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶活性测定以及活化、降解Cry1Ac毒素分析

昆虫中肠对Bt原毒素活化与对活化毒素降解的变化被认为是害虫对Bt产生的机制之一,研究比较棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)与甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)的中肠液、BBMV蛋白酶的活性,通过SDS-PAGE分析2种昆虫对原毒素的活化速度与对活化毒素的降解速度。2种昆虫的中肠液蛋白酶活性均显著高于BBMV蛋白酶活性,中肠液与BBMV均能迅速活化原毒素并继续降解活化后的毒素,与中肠液相比,BBMV对原毒素的活化与对活化毒素的降解均慢于中肠液,甜菜夜蛾对毒素的活化与降解又慢于棉铃虫。另外,还测定抑制剂对中肠液蛋白酶活性的抑制作用,结果表明,各抑制剂对棉铃虫和甜菜夜蛾相应酶活性的抑制表现出相同的趋势,TLCK对丝氨酶蛋白酶具较好的抑制作用,而PMSF对胰蛋白酶的抑制作用次之,TPCK对胰凝乳蛋白酶的抑制作用较弱。

生长猪小肠钠依赖型磷摄入特性的研究

选取6头体重接近的3月龄生长期大白猪,屠宰后刮下肠黏膜,提取3段小肠上皮细胞刷状缘膜囊泡(Brush-border membrane vesicles,BBMV)。在室温条件下,研究各段小肠BBMV磷的摄入量,pH和钠离子依赖性,并测定BBMV磷吸收动力学参数。结果表明,生长猪BBMV对磷的主动吸收和被动扩散在酸性pH下均受到抑制。钠离子水平影响BBMV磷的主动吸收。pH7.4条件下,测得钠依赖型磷转运系统Hill系数(napp)为2.07,即转运1个磷酸根,至少有2个钠离子与其协同转运。不同肠段BBMV磷的主动吸收并没有显著差异。pH7.4条件下,生长猪钠依赖型磷转运系统对磷的亲和力常数(Km)为(0.43±0.09)mmol/L。最大转运速度(Vmax)为(2.25±0.19)nmol/(mg蛋白.15 s)。

棉铃虫幼虫中肠细胞脂筏的制备及鉴定

脂筏是细胞膜上富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇锚着蛋白的去垢剂不溶性微结构域,被认为是多种细胞膜孔毒素在细胞表面形成寡聚体的平台。为研究脂筏与Bt毒素在细胞膜上形成寡聚体膜孔的关系,本文对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠脂筏的制备与鉴定方法进行了研究。根据脂筏在低温(4℃)下不溶于去垢剂的特性,采用Triton X-100处理棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡,溶解非脂质筏成分,以OptiPrep为介质进行密度梯度离心,分离去垢剂不溶组分,成功地得到了棉铃虫幼虫中肠上皮细胞的脂筏。再以脂筏的特有化学成分神经节苷脂GM1作为脂筏的标志分子,利用霍乱毒素β亚基能与GM1特异性结合的特性,以辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素β亚基用点印迹法化学发光检测神经节苷脂的分布,从而对脂筏进行定性鉴定。结果表明我们建立的脂筏制备方法简便、易行,比传统的蔗糖梯度离心法大大缩短了制备所需时间。

杀虫活性化合物杠柳新苷P对东方粘虫中肠细胞上结合蛋白的影响

杠柳新苷P是从杠柳根皮提取物中分离得到的一种甾体糖苷类化合物,对东方粘虫表现出较好的杀虫活性。为了进一步研究其杀虫机理,探究杠柳新苷P作用于东方粘虫中肠疑似作用位点,通过对杠柳新苷P进行结构修饰,与东方粘虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)组织体外孵育,利用其结构修饰后增强的紫外吸收特性,经蛋白分离、纯化,进而得到杠柳新苷P作用于粘虫中肠BBMV上的结合蛋白。结果表明:在粘虫中肠BBMV上存在杠柳新苷P的疑似结合蛋白,且经分离鉴定得到5种疑似结合蛋白,分别为类异翅盘蛋白、氨肽酶、二硫键异构酶、苯基贮存蛋白以及精氨酸激酶;通过进一步的分析推测,氨肽酶可能是杠柳新苷P作用于东方粘虫幼虫中肠BBMV上的结合蛋白。初步明确杠柳新苷P作用于东方粘虫中肠的疑似作用位点,但仍需进一步的验证工作进行确认,为今后研究杠柳新苷类化合物的作用机理及靶标提供依据。

亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白的交互抗性分析

Cry9Ee是近年来发现的对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)等害虫具有高毒力的蛋白,具有良好的应用前景。为了明确亚洲玉米螟对Cry9Ee和Cry1Ab蛋白是否存在交互抗性,本文首先分别表达、活化、纯化了Cry9Ee和Cry1Ab蛋白,进而对敏感和Cry1Ab抗性亚洲玉米螟进行生物活性测定;随后对2种蛋白在敏感亚洲玉米螟中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,简称BBMVs)上的结合进行分析比较。生物活性测定结果表明,Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的活性片段对敏感亚洲玉米螟的LC50分别为3.04和0.89μg/g;而Cry9Ee活性片段在5.00μg/g的浓度下,对Cry1Ab蛋白抗性亚洲玉米螟致死率高达96%,与对敏感种群活性相当。竞争结合试验表明,Cry9Ee和Cry1Ab两种蛋白间不存在竞争结合,推测它们在亚洲玉米螟中肠上存在不同的受体。综合生物活性测定及体外结合试验两方面结果得出结论:亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白不存在交互抗性。cry9Ee基因可以作为理想的候选基因,用于我国新一代转基因抗虫玉米的研制,为延缓和克服亚洲玉米螟对转基因抗虫玉米抗性的产生提供重要保证。

Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫机理

为研究苏云金杆菌Cry2Aa毒素的生物活性及杀虫机理,先利用浸叶法测定了商品化的Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫活性,并用石蜡包埋切片后进行免疫组化分析,再用ELISA法测定了Cry2Aa毒素与小菜蛾刷状缘膜囊泡(BBMV)的结合曲线,最后通过Ligand blot法和肽指纹质谱对小菜蛾BBMV与Cry2Aa毒素的结合蛋白进行了分离与鉴定。结果表明,Cry2Aa毒素对小菜蛾的半数致死浓度(LC_(50))为27.90μg/ml。Cry2Aa毒素与小菜蛾中肠上皮细胞存在结合,与小菜蛾BBMV的表观结合亲和力为266.6 nmol/L。小菜蛾BBMV与Cry2Aa毒素存在5条主要结合条带,其中分子量2.45×10~5上方的主结合条带酶解后得到ATYSEGPNGSVR片段,通过数据库比对分析,匹配到一个分子量为3.32×10~5的小菜蛾未鉴定蛋白,其功能注释为脂质运载蛋白。