仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的分离鉴定及其益生特性分析

利用MRS固体培养基从南移仿刺参肠道中分离得到1株优势乳酸菌,命名为AJC-XP-15,其最适生长温度为30℃,最适生长pH为6.5;其表面疏水性和自聚率分别为34.56%和35.61%,经16S RNA基因序列分析,并结合形态学和生理生化特性将其鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。拮抗实验结果显示,菌株AJC-XP-15及其发酵上清液对塔氏弧菌(Vibriotubiashii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus,VP)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等病原菌具有很好的抑制作用;体外益生实验表明,菌株AJC-XP-15对人工胃肠液的耐受性很好,在pH3.0的模拟人工胃液处理3 h后的存活率为71.43%,在pH 6.8的模拟人工肠液处理3 h后的存活率为92.1%;抗氧化能力结果显示,菌株AJC-XP-15的无细胞提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力最强,分别为(82.67±6.92)%和(15.36±2.95)%,其发酵上清液对超氧阴离子自由基的清除能力最强,为(26.36±2.58)%;药物敏感性分析结果显示,菌株AJC-XP-15对四环素、恩诺沙星、盐酸多西环素等抗生素敏感,对氟苯尼考、复方新诺明、庆大霉素等抗生素不敏感。研究结果可为仿刺参肠道源乳酸菌的分离鉴定和候选益生菌种筛选提供参考依据。

不同水平包膜丁酸钠对刺参(Apostichopus japonicus)生长性能、消化酶活性、非特异性免疫和抗病力的影响

评价了饲料中添加不同水平包膜丁酸钠(DZ、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 g/kg)对刺参(Apostichopus japonicus)的生长性能、消化酶活性、非特异性免疫和抗病力的影响,为期60 d。结果表明,2.0和3.0 g/kg组刺参末体重、增重率和特定生长率显著高于DZ组(P<0.05)。各处理组刺参成活率显著高于DZ组(P<0.05)。与DZ组相比,2.0和3.0 g/kg组刺参脏壁比和饲料转化率显著降低(P<0.05)。2.0、3.0 g/kg和5.0 g/kg组刺参肠道淀粉酶活性显著高于DZ和1.0 g/kg组(P<0.05)。2.0、3.0、4.0 g/kg组刺参肠道蛋白酶活性显著高于DZ组(P<0.05)。2.0、3.0、4.0、5.0 g/kg组刺参肠道脂肪酶活性显著高于DZ组(P<0.05)。与DZ组相比,2.0 g/kg和3.0 g/kg组刺参超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性均显著提高(P<0.05)。然而4.0和5.0 g/kg组只诱导了部分非特异性免疫。灿烂弧菌攻毒实验表明,2.0、3.0 g/kg和4.0 g/kg组刺参的累积死亡率显著低于对照组(P<0.05)。综上所述,饲料中添加2.0 g/kg和3.0 g/kg包膜丁酸钠可提高刺参的生长性能、消化酶活性、非特异性免疫和抗病力。在考虑经济成本的情况下,刺参日粮中添加2.0 g/kg包膜丁酸钠为最佳剂量。

盐度对刺参(Apostichopus japonicus)呼吸和排泄的影响

采用封闭式呼吸器法研究了(15±0.5)℃水温条件下不同盐度(22、27、31.5、36)对四种规格刺参{S[(39.60±8.77)g]、M[(71.80±14.04)g]、L[(128.30±19.69)g]和XL[(196.65±19.81)g]}呼吸和排泄的影响。结果表明,各规格组刺参单位体重耗氧率[Rwr,μg/(g·h)]和排氨率[(Rwe,μg/(g·h)]在盐度22—31.5范围内均随着盐度的升高而降低,当盐度升高至36时,二者都明显升高;各盐度下实验刺参的单位体重耗氧率分别为17.52、16.32、15.49和17.60μg/(g·h),单位体重排氨率分别为1.05、0.88、0.87和0.95μg/(g·h);在同一盐度下,刺参体重越大,其单位个体耗氧率[Rir,μg/(ind·h)]和排氨率[Rie,μg/(ind·h)]越高,二者呈幂函数关系,可用关系式Rir(或Rie)=aWb表示;关系式Rir=aWb中,a值的变动范围为40.6656—81.1900,b值为0.6432—0.8145;而关系式Rie=aWb中,a值的变动范围为2.0947—4.8489,b值为0.6507—0.8072;盐度对刺参O∶N比的影响不显著,各盐度条件下,不同规格的刺参,其O∶N比均在15左右,表明本实验条件下该参代谢所需要的能量主要由脂肪和碳水化合物提供。从呼吸和排泄的角度来看,刺参在其最适温度(15℃)条件下,具有一定的渗透压调节能力,能够适应较广的盐度变化范围(22—36)。

温度和pH对刺参(Apostichopus japonicus)消化酶活力的影响

消化酶活力能够反映刺参对不同营养成分的消化能力。当某一反应条件发生改变时,消化酶的活力大小就会发生变化,因此研究不同因子对消化酶活力的影响对于了解消化酶的性质具有重要的意义。温度和pH是影响消化酶活力的最重要的反应条件。本文中作者应用酶学分析研究了温度和pH对剌参前肠和中肠各种消化酶活力的影响。蛋白酶活力测定采用福林-酚法,脂肪酶活力测定采用水解法,淀粉酶活力和纤维素酶活力测定采用水杨酸显色法。实验结果表明,反应温度和反应pH对刺参前肠和中肠中的消化酶活力具有显著影响(P<0.05)。前肠和中肠中蛋白酶活力均在反应温度为50℃时达到最大值,前肠和中肠中脂肪酶和纤维素酶均在反应温度为40℃时达到最大值,而前肠和中肠中淀粉酶最适反应温度分别为40℃和30℃。刺参前肠蛋白酶活力在酸性环境下较中肠高,且在反应pH为5.0—5.8之间酶活力相对稳定,而中肠蛋白酶活力在碱性环境下较前肠高,且在反应pH为7.0—8.6之间酶活力相对稳定;刺参前肠脂肪酶活力随着pH的升高出现两个相对稳定的峰值,分别为4.2—5.0和6.2—7.0区间,中肠脂肪酶活力在pH为3.8时达到最大值,而在pH超过9.0明显失活:剌参前肠和中肠淀粉酶活力在pH变化时表现出相似的变化趋势,在反应pH为6.6—7.4之间酶活力较高且相对稳定;剌参前肠和中肠中纤维素酶活力在pH变化时反应不一致,前肠淀粉酶在反应pH为6.2—7.4之间酶活力较高且相对稳定,中肠纤维素酶活力在反应pH为5.4—7.0之间酶活力较高且相对稳定。此外,通过比较四种消化酶比活力值的大小,可以看出剌参蛋白酶活力最高,其次为纤维素酶和淀粉酶活力,而脂肪酶活力最低。

夏眠对刺参(Apostichopus japonicus (Selenka))能量收支的影响

夏眠是刺参最重要的生理特征;水温升高是其夏眠的主要诱发因子,而夏眠的临界温度与刺参体重密切相关。为揭示刺参夏眠对其能量利用对策的影响,测定了2种体重规格(134.0±13.5)g和(73.6±2.2)g刺参在10、15、20、25℃和30℃5个温度梯度下的能量收支。结果表明,温度和体重及其交互作用对刺参能量的摄入均有显著影响;而温度是影响其摄食能分配的主要因素。研究发现,刺参在非夏眠期、夏眠临界期和完全夏眠期的能量利用对策有所不同:在非夏眠期,刺参摄食能支出的最大组分是粪便能,占摄食能的比例超过50%,其次为呼吸耗能,占19.8%～39.4%,而生长能和排泄能占的比例较小,分别为5.7%～10.7%和2.9%～3.7%;在夏眠临界温度下,呼吸和排泄耗能占摄食能的比例均显著增大(分别为88.3%和13.6%),而生长能所占比例降为负值(-55.3%),刺参表现为负生长;而在夏眠期,刺参的摄食能和排粪能为零,为维持其基本生理活动,不得不动用以往贮存于体内的能量,消耗于呼吸和排泄等生理过程,供维持生命之用。总之,从能量生物学的角度看,夏眠的主要生态学意义在于刺参长时间处于相对高温环境,进而导致摄食受阻条件下的一种能量节约方式。

海刺参(Stichopus japonicus)电压依赖性钙离子通道β亚基基因及其编码产物的结构特点

电压依赖性钙离子通道(voltage-dependent calcium channels,VDCC)是细胞膜上控制Ca2+进入胞内的特殊蛋白质,VDCCβ亚基具有调节其通道活性的作用.使用RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到电压依赖性钙离子通道β亚基(SjCaβ)基因,所得序列提交GenBank,登录号EU853658.该基因全长1 867 bp,包含1个1 614 bp的开放阅读框(ORF),编码537个氨基酸.将SjCaβ与多种无脊椎动物钙离子通道β亚基进行分析比较,发现它们有较高的同源性,并具有钙离子通道β亚基基因内保守的2个功能区域,即SH3功能区(src-homology 3 domain)和GK功能区(guanylate kinase domain).在功能区域附近还具有电压依赖性钙离子通道β亚基特有的BID区(βinteraction domain),氨基酸保守序列为PYDVVP-RP---VGPSLKGYEVTDMMQKALFDF,进一步确定了得到的cDNA序列为海刺参电压依赖性钙离子通道β亚基.对SjCaβ的二级结构进行了预测,构建了系统进化发育树,并运用同源建模法构建了SjCaβ的三维结构模型.研究结果对深入研究海刺参离子通道的结构以及在信号传导过程中的作用有着重要意义,并为研究海刺参自溶等问题提供一定的理论基础.

温度与盐度对刺参(Apostichopus japonicus)生长的影响

采用实验生态学模拟方法,研究了经40d处理后温度与盐度对刺参生长的影响,以特定生长率(SGR)与净增重为参数反映生长状况。结果不同温度与盐度处理对刺参生长的影响均呈先升高后降低趋势。刺参SGR在温度为17℃时达最大值,为2.031±2.772%.d-1,体重净增长量达最大值9.247±12.179g;在盐度为30时达最大值3.067±2.069%.d-1,净增长量12.668±12.717g。根据回归曲线得出刺参最快生长温度是16.8℃,盐度是31。

刺参(Apostichopus japonicus)EST序列中微卫星分布分析及其标记的筛选

利用微卫星查找软件对现已公布的6632条刺参ESTs的数据库中2—6个碱基重复单元组成的简单序列重复进行筛选,进而对其微卫星的丰度和分布进行比较研究。共发现微卫星序列416个,占整个ESTs数据库的6.48%;其中含双碱基重复序列146个,数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的65.86%;三、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的26.68%、1.68%、0.24%、5.53%。对含有SSR位点符合微卫星引物设计的EST序列利用Primer软件结合人工方法设计合成引物21对,其中13对有扩增产物且均为多态位点。扩增产物变性聚丙烯酰胺胶电泳,统计每个微卫星标记等位基因数目,计算等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度等统计学指标的评价。结果表明,在13个微卫星位点上,等位基因的数目从3到8不等,等位基因长度从175—382bp,观测杂合度和期望杂合度分别为0.158—0.650和0.198—0.841,所筛选微卫星标记可于遗传分析。

仿刺参(Apostichopus japonicus)mtDNA三个基因片段的序列分析

采用PCR技术对中国烟台、威海和莱州三个地点仿刺参的16S rRNA、COI、IrRNA-COI三个mtDNA基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度约为570bp、640bp和900bp的三段序列,分析了三个采样点样品的遗传多样性。结果表明,每段基因序列扩增均获得两种单倍型,已在Genbank中注册(注册号码:AY852278—AY852283)。通过比较,三个地点样品的序列差异不显著,无缺失、插入、颠换的现象,只有个别位点出现转换,其中16S rRNA序列最为保守,16S rRNA、COI、IrRNA-COI三段序列A+T的平均含量为56·2%、59·2%、61·8%,均大于G+C含量。三个采样点样品同源性为99·84%—99·96%。将获得的仿刺参DNA序列和Genbank中的来自东太平洋8个外群进行基因序列比较,结果发现,不同目、科的海参的序列差异显著。采用DNAsp统计了各类位点数;MEGA2·1分析了碱基组成和遗传距离,构建了系统树。系统树体现的分类关系与这些物种的形态学分类关系完全一致。

刺参(Apostichopus japonicus)不同组织基因组甲基化状态MSAP分析

利用MSAP技术分析成体刺参的呼吸树、肠、肌肉和体壁等组织的基因组DNA甲基化水平,获得了四个组织基因组甲基化率。甲基化水平由高到低依次是呼吸树、体壁、肌肉和肠,分别是35.77%、33.51%、32.72%和28.0%,其中全甲基化位点各占19.46%、18.39%、19.18%和15.97%。统计学分析结果显示肠组织的甲基化水平与其它组织的差异显著(P<0.05),其余三个组织间差异不显著(P>0.05),但呼吸树与肌肉的半甲基化水平差异显著(P<0.05)。由MSAP分析差异位点克隆得到四个甲基化特异性片段,经测序分析功能未知,推测为刺参基因足非编码区或新功能基因序列。

汞、镉、硒对刺参(Apostichopus japonicus)幼参的单一毒性与联合毒性

在水温15.5—17.0℃的静水条件下,以Hg2+、Cd2+和Se4+对刺参幼参进行了单一毒性和联合毒性实验。联合毒性实验采用等毒性配比法,并以Marking相加指数评价联合毒性效应。单一毒性实验结果表明,Hg2+、Cd2+、Se4+对刺参幼参急性毒性的96h半致死质量浓度(LC50)分别为0.0912、4.6433和0.7413mg/L,三者对幼参的毒性大小依次为Hg2+>Se4+>Cd2+。Hg2+、Cd2+、Se4+对刺参幼参的最大容许质量浓度分别为0.0009、0.0464、0.0074mg/L。联合毒性实验结果表明,当Hg2+-Cd2+、Hg2+-Se4+以及Cd2+-Se4+分别以等毒性混合物共存时,它们对刺参幼参在24h、48h、72h和96h的联合毒性均为拮抗作用;当Hg2+-Cd2+-Se4+三者以等毒性混合共存时,它们对刺参幼参在24h、48h、72h和96h的联合毒性仍为拮抗作用。讨论了Hg2+、Cd2+、Se4+对刺参幼参联合毒性效应的机制。

微卫星标记在刺参(Apostichopus japonicus)人工繁育中亲本识别的应用

选取8个高多态性的微卫星位点,对240只刺参(Apostichopus japonicus)幼体和14只疑似亲本进行了亲缘关系的鉴定。通过检测,8个微卫星位点共得到53个等位基因,平均等位基因数为6.63;观察杂合度在0.730—0.902;各位点的多态信息含量为0.696—0.836。通过亲缘关系分析软件CERVUS 3.0分析,微卫星位点累积排除概率分别为0.9934、0.9997、0.99999。基于排除法个体基因型判定,有37个子代有1个候选亲本,194个子代有2个及以上候选亲本;基于似然法判定,置信度为80%时,有198个子代个体找到最似亲本。综合排除法和似然法的亲权鉴定,成功为229个子代个体找到它们的亲本,鉴定成功率达95%以上。本研究结果可为刺参育种工作中亲本识别及家系分析提供技术支持和理论依据。

刺参(Apostichopus japonicus)夏眠期间消化道的组织学研究

运用切片和扫描电镜技术对刺参夏眠状态和正常状态的消化道进行了组织学比较研究。结果表明,与正常状态下相比,进入夏眠后刺参消化道发生退化,消化道整体变细,变短。消化道各部分的界限变得不明显。消化道基本结构未发生变化,仍然由粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜组成。但内表面柱状细胞变矮,皱襞减少,纤毛和微绒毛几乎完全脱落,分泌颗粒减少或消失。粘膜下层结缔组织变得稀疏,细胞数目减少。肌层变薄。外膜外表面的变化不大,但出现增厚的现象。对于不同夏眠阶段刺参消化道的区别有待于进一步研究。

中国刺参(Apostichopus japonicus)与韩国刺参杂交子一代生长和抗病力比较

采用完全双列杂交法对刺参中国群体(C)和韩国群体(K)进行群体间杂交和群体内自繁,获得C(♀)×C(♂)、K(♀)×K(♂)、K(♀)×C(♂)和C(♀)×K(♂)4个交配组合的子一代。分析了各交配组受精率、孵化率、附着变态率、浮游幼体和幼参阶段的生长和抗病能力以及杂交子代的杂种优势。结果显示,杂交组与自繁组在受精率和孵化率等方面不存在显著性差异,杂交组附着变态率高于自繁组。C(♀)×K(♂)组在幼参期体长平均值均大于其他3个组,并表现出显著性差异,其体长杂种优势率在9.43%–23.75%之间;其体重从150日龄后表现出杂种优势,在4.09%–34.96%之间。而K(♀)×C(♂)组在幼参期体长和体重除在150日龄时表现为杂种优势,其他时间均表现为杂种劣势。K(♀)×C(♂)组抗灿烂弧菌病能力最强,杂种优势率为26.21%。

刺参(Apostichopus japonicus)野生及两代选育群体间遗传变异的微卫星标记研究

应用微卫星DNA技术对野生刺参和两代选育刺参群体遗传多样性进行了研究。9对微卫星引物在三个刺参群体中共扩增获得43个等位基因,每个微卫星座位检测到的等位基因数为2—7个。三个群体的观测杂合度的平均值分别为0.6556、0.6704和0.6148,多态信息含量平均值分别为0.6654、0.5929和0.5275。结果表明,与野生群体相比,选育刺参两代群体存在杂合度降低,遗传多样性下降的现象。Hardy-Weinberg平衡的卡方检验及F-检验数据显示3个群体在某些位点都出现了杂合子缺失,偏离平衡的位点逐代增加,相邻世代之间遗传分化系数逐代减小,人工累代选育已经使群体的遗传结构发生了变化。FST平均值0.0443提示出选育群体处在较弱的分化水平,说明遗传变异主要来自于群体内个体间。遗传距离及遗传相似性结果显示随着选育世代的增加,世代之间遗传距离越来越小,遗传相似性越来越大,但与理论值仍有差距,选育群体刺参仍具育种潜力。

池塘养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物、附着基和底泥中的菌群结构及其相关性

2014年10月,利用PCR-DGGE技术分析了标准化养殖池塘中仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物及附着基和底泥中细菌的菌群结构及其相关性。结果显示,仿刺参肠含物、附着基、底泥中细菌多样性较高,分别平均获得30.00±1.00、15.33±1.70、21.67±2.62条带,肠含物中细菌种类数显著高于附着基和底泥。聚类分析和戴斯系数表明,不同池塘的仿刺参肠含物样本单独聚为一支,相似性达到0.785,附着基和底泥样品聚为一支,平均相似性达到0.532。不同样品DGGE图谱中20条优势条带的切割、克隆、测序,共获得了20条细菌序列,表明肠含物细菌种类以聚球藻属(Synechococcus sp.)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫叠球菌属(Desulfosarcina sp.)、极地杆菌属(Polaribacter)、Algibacter sp.为主,附着基中主要以Robiginitalea sp.和Silicibacter sp.为主,底泥样品中主要以假单胞菌属(Proteobacterium)、噬胞菌属(Cytophaga)、Desulfosarcina sp.为主,肠含物中细菌特有种类的分离与鉴定为仿刺参养殖潜在益生菌的开发提供基础数据。

仿刺参(Apostichopus japonicus)摄食和运动器官的结构与功能

触手、管足是仿刺参(Apostichopus japonicus)的摄食和运动器官,对食物选择和生境斑块选择有着重要影响。本研究利用组织学、组织化学、透射电镜和扫描电镜技术对仿刺参触手、管足的组织结构,粘液细胞类型进行了研究,并探讨了触手和管足结构与功能的关系。研究查明了仿刺参触手柄部组织结构由外至内为角质层、上皮、疏松结缔组织、致密结缔组织、神经丛、纵肌层、间皮;触手末端与柄部结构组成基本相同,仅乳突腹面上皮加厚。管足吸盘由外自内依次为角质层、上皮、神经丛、结缔组织、端板、间皮。触手和管足细胞多含酸性粘多糖。触手乳突腹面分布有一种含有颗粒囊泡的粘液细胞,管足吸盘腹面存在有纤毛的非分泌细胞(CNS)、支持细胞(SC)、无纤毛细胞(NCS)。

南移养殖的刺参(Apostichopus japonicus)cDNA文库的构建及原肌球蛋白基因的研究

以南移养殖的刺参为实验材料,采用非均一化的Oliga-dT引物定向克隆技术构建了南移刺参混合组织的cDNA文库。对文库质量的分析结果表明,cDNA文库的库容量为2.2×107cfu,重组率达95.8%,平均插入片段长度750bp左右。挑取cDNA克隆进行5’端测序,成功测序185个反应,分析得到136个单基因簇(Unigene),其中包括40个重叠群(Contigs)、96个单拷贝EST(Singletons)。结果表明,克隆南移养殖的刺参原肌球蛋白(tropomyosin,Trp)cDNA全长序列为1112bp,ORF编码284个氨基酸,其预测蛋白的分子量为33.27kDa,等电点为4.56。该氨基酸序列与紫石海胆、南极大磷虾、锯缘青蟹、文昌鱼、河蟹、家蚕同源性分别为62%、51%、46%、49%、47%、46%。

刺参(Apostichopus japonicus)高温胁迫消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)研究刺参高温胁迫下差异表达的基因。分别以高温实验组为检测组(tester)、常温对照组为驱动组(driver),进行正向抑制性消减杂交;以常温组为tester、高温组为driver,进行反向消减杂交,成功构建了刺参正反双向差异消减文库。从两个文库随机挑选384个白斑克隆进行斑点杂交进一步筛选,对其中差异显著的50个克隆进行测序分析。测序结果经BLAST比对分析得出:44个克隆与已知基因序列高度同源,主要包括3个上调表达基因和2个下调表达基因;另外5个克隆为未知新基因序列。该消减文库的成功构建对刺参耐高温相关基因的深入研究以及阐述耐高温的分子机理有非常重要的意义。