重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a在大肠杆菌中的表达和纯化

为了大量制备重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa) ,对构建的基因工程菌株E .coliBL2 1(DE3)pET2 2b mETIa进行了表达条件的优化 .用摇瓶培养 ,rETIa蛋白占菌体总蛋白 4 0 %以上 .经破碎菌体 洗涤包涵体 溶解包涵体 复性初步纯化后 ,再经二步柱层析纯化获得电泳纯的rETIa蛋白 .测定了rETIa对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织型纤溶酶原激活因子缺失突变体 (NTA)的抑制活性 .

刺桐胰蛋白酶抑制剂亲和层析填料的制备及应用

研究用交联琼脂糖为载体 ,三聚氯氰为活化剂 ,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基 ,制备亲和填料的方法 .通过紫外和红外光谱分析 ,对制备的填料进行表征 .用制备的亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体(reteplase,r- PA) ,研究吸附与解吸附条件 .结果表明 ,用该方法制备的亲和填料 ,制备工艺简单 ,吸附性能良好 ,对r- PA的吸附量为 8.76 mg· g- 1 .解吸附完全 ,不影响活性 ,可以用来分离纯化 r- PA.

刺桐胰蛋白酶抑制剂基因的构建及表达研究

刺桐胰蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂及瑞替普酶特异性的抑制剂 ,可作为配基制成亲合填料用于纯化上述酶。通过化学合成和PCR结合法合成了ETI基因 ,经过序列分析后将其克隆到大肠杆菌表达载体质粒pET32a中 ,并在大肠杆菌中进行诱导表达。表达蛋白分子量同理论值一致 ,生物活性检测表明复性后的ETI对胰蛋白酶及瑞替普酶具有特异抑制作用。

刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体在大肠杆菌中表达及在tPA纯化中的应用

目的构建刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体(rserETI)原核表达载体,制备表达产物,用于tPA的纯化。方法设计合成rserETI编码序列DNA片段,以PCR法扩增出全长编码区序列,经酶切后克隆至pET9a表达载体,转化大肠杆菌JM109DE3,以IPTG诱导表达。表达产物经变性、复性、QFF层析纯化后,测定其活性,并与溴化氰活化的Sepharose偶联合成亲和层析柱,纯化rtPA。结果rserETI的表达量约占大肠杆菌菌体总蛋白的30%,复性率为80%,经QFF层析纯化后,蛋白浓度为1.58mg/ml,SDS-PAGE检测显示无杂蛋白污染,纯度大于95%,对rtPA突变体的抑制比活性为4×104IU/mg。偶联合成的rserETI-Sepharose亲和层析柱能特异性地纯化rtPA,rtPA突变体纯度达96%,比活性为5.07×105IU/mg。结论已成功构建了rserETI原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,制备的表达产物可用于rtPA的纯化。

刺桐胰蛋白酶抑制剂的色谱复性研究

目的 研究在大肠杆菌中表达的刺桐胰蛋白酶抑制剂 (Erythrinatrypsininhibitor,ETI)的色谱复性。方法 使用透析、阴离子交换和凝胶色谱法对ETI复性进行研究 ,比较 3种复性方法的相对复性率及蛋白质回收率。结果 3种复性方法的复性率分别为 2 0 . 1% ,32 . 1%和 5 0 . 8% ,蛋白质回收率分别为 16 . 6 % ,15 . 1%和 5 5 . 2 %。结论 凝胶色谱复性优于其他两种方法。色谱复性使蛋白质的复性与纯化同步进行 ,简化了操作程序 ,提高了产品的回收率。

刺桐胰蛋白酶抑制剂亲和填料的制备及纯化瑞替普酶

刺桐属胰蛋白酶抑制剂 (ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂 ,能特异性的抑制胰蛋白酶、组织纤溶酶原激活剂 (t PA)、瑞替普酶 (r PA)等丝氨酸蛋白酶。实验利用ETI工程菌 ,经诱导表达、体外复性及纯化获得ETI蛋白 ,并将该蛋白键合到CNBr活化的琼脂糖凝胶 ,制备ETI亲和填料 。

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定(英文)

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( +)中构建重组表达质粒pET25b ( +)/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的复性纯化

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及组织纤溶酶原激活剂(t-PA)等。本研究利用大肠杆菌高密度发酵表达ETI,产物以包涵体形式存在,经体外以脉冲稀释的方式复性并纯化后,每升发酵液可得ETI1000mg以上,纯度大于95%,比活为1.55IU/mg。ETI制成的ETI-Sepharose亲和胶,每ml可吸附重组瑞特普酶融合蛋白(Trx-rPA)2mg,可应用于制备t-PA及其衍生物如r-PA等药用蛋白。

刺桐胰蛋白酶抑制剂的高效表达、纯化、亲和介质的制备及其在r-PA纯化中的应用

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,能够特异性结合胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂,抑制其活性。因此ETI可以作为配体与固定相偶联制备亲和层析介质,用于tPA(组织型纤溶酶原激活剂)及其突变体的纯化。利用基因工程方法构建了ETI的高表达工程菌株,诱导表达后目的蛋白占总蛋白的39.6%,经包涵体变性、复性、纯化,制备了纯度高于96%的ETI样品,收率达到了63.5%。利用纯化的ETI,偶联制备了亲和层析介质,偶联率达到99%。用制备的ETI亲和层析介质纯化瑞替普酶(r-PA),获得的r-PA样品纯度高于95%,生物学活性高于5×105U/mg。本研究为ETI的进一步生产及应用奠定了基础。

以乳糖为诱导剂的高密度发酵

以重组刺桐胰蛋白酶抑制剂 (r ETIa)为目的产物 ,用摇瓶比较了以异丙基 -β- D-半乳糖苷和乳糖诱导表达的差异 ,并在 15 L发酵罐中 ,以乳糖为诱导剂进行高密度发酵 ,摸索了诱导后碳、氮补加工艺对产物表达的影响 ,成功地使菌体密度达到 6 1(A6 0 0 ) ,表达量达到菌体总蛋白的 33% ,为乳糖替代