利用合成生物学技术促进刺糖多孢菌多杀菌素的高效合成

多杀菌素是由刺糖多孢菌产生的次级代谢产物,具有绿色、高效、杀虫谱广等特点,是当前国际上生物杀虫农药的重点研究对象。多杀菌素及其类似物丁烯基多杀菌素的特殊结构决定了其杀虫独特的作用机理。当前,为满足大规模工业化生产的需求,研究人员致力于提高多杀菌素及丁烯基多杀菌素的产量,其中应用合成生物学技术在提高产量上取得了突出成就。本文综述了国内外通过合成生物学相关技术调控代谢途径以提高多杀菌素和丁烯基多杀菌素产量的研究,重点从底盘细胞改造与优化、合成生物系统构建、基因路线改造、代谢网络调控等方面进行了阐述,并提出和探讨了利用合成生物学技术进一步提高多杀菌素产量的技术策略,同时对未来的研究方向进行了展望,为利用合成生物学技术促进多杀菌素的生物合成提供了新的研究策略。

环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因(crp),通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-PermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-PermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-PermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-PermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S.spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S.spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S.spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S.spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S.spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S.spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高,分支较少,有利于提高工程菌株S.spinosa-Crp发酵过程中的溶氧水平。摇瓶发酵结果表明,工程菌株中的多杀菌素产量与对照菌株相比提高了128%。【结论】crp的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响,并有效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成,为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。

刺糖多孢菌生长特性及培养条件的优化

研究了多杀菌素生产菌株的生长特性及种子培养条件对其发酵产量的影响。采用单因素试验确定刺糖多孢菌C3-10-4的最优种子培养基和最佳培养温度,同时采用正交设计对刺糖多孢菌C3-10-4培养基装量、摇床转速和添加玻璃珠个数进行了优化,并运用Gompertz模型拟合其生长曲线。结果表明:最佳种子培养基为:胰蛋白酶大豆肉汤30 g、酵母提取物3 g、硫酸镁2 g、葡萄糖10 g、去离子水1 L;最优种子培养条件为:培养温度为29℃,摇床转速240 r/min、玻璃珠6个、培养基装量30 mL/250 mL,在该培养条件下,可获得最大生物量。

刺糖多孢菌原生质体制备与再生条件优化

目的研究多杀菌素产生菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)原生质体制备与再生的最佳条件。方法利用数理统计的方法研究了不同制备培养基、菌龄、甘氨酸浓度、溶菌酶处理条件以及再生培养基对原生质体制备和再生的影响,并考察了原生质体的适宜保藏温度。结果菌体在添加0.3%甘氨酸的EHC培养基中培养72h,用2mg/mL溶菌酶32℃酶解40min后,涂布在再生培养基R6上再生,原生质体制备率超过99%,再生数可达到107cfu/mL。刺糖多孢菌原生质体可置于4℃短期保存72h,长期保存需要放置于-80℃条件下。结论优化的结果为刺糖多孢菌原生质体融合育种和遗传转化体系建立奠定了基础。

磷酸甘露酶基因的阻断对刺糖多孢菌的形态及其多杀菌素合成的影响

磷酸甘露酶(PMM)是由manB基因编码的广泛存在于真核生物中的蛋白酶,在糖代谢过程中磷酸-6-甘露糖可在磷酸甘露酶的作用下转化为磷酸-1-甘露糖,与细胞的初级代谢过程及次级代谢产物的合成过程密切相关,可通过对刺糖多孢菌中与初级代谢途径相关的基因进行分析改造,促使多杀菌素的合成显著提高。本研究在刺糖多孢菌基因组中克隆了磷酸甘露酶编码基因manB的部分片段,将其与穿梭载体pOJ260连接,构建了阻断型载体pOJ260-manB。通过接合转移将其导入刺糖多孢菌野生菌中,获得刺糖多孢菌突变菌株S.spinosa-△manB。将突变菌株接种至不同培养基,观察突变菌株与野生菌株的孢子形成情况,发现突变菌株的孢子萌发有所提前,且孢子产生量比野生菌略多;在HPLC上检测多杀菌素的产量发现突变菌株的产量相对于野生菌株提高了180%,这说明manB基因对刺糖多孢菌的生长发育有一定的影响,并对调控多杀菌素的合成具有重要作用。

聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响

聚磷酸激酶基因(Polyphosphate kinase gene,ppk)是放线霉菌中的一种影响抗生素合成的全局性负调控因子,阻断该基因能显著提高其次级代谢产物产量。本文利用PCR扩增了刺糖多孢菌中的ppk基因中间片段,经酶切连接技术将其克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pOJ260上,构建阻断型载体pOJ260-ppk;通过接合转移将该功能质粒导入刺糖多孢菌中,获得了遗传性能稳定的重组菌株S.sp-△ppk。对工程菌株的PCR检测结果显示,ppk基因片段已整合到刺糖多孢菌染色体上并成功阻断了该基因的表达。摇瓶发酵结果显示,工程菌株多杀菌素产量较原始菌株提高了122%。阻断聚磷酸激酶基因的表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长发育产生了影响,并有效地促进该菌多杀菌素的生物合成。

刺糖多孢菌高产菌株转录组及其多杀菌素合成代谢调控研究

目的 通过对高产多杀菌素的刺糖多孢菌进行转录组分析,挖掘多杀菌素合成相关代谢通路的差异基因,并在此基础上结合发酵优化进一步提高多杀菌素产量。方法 利用RNA-seq技术对高产株SS-168及低产野生菌株SS-WT进行比较转录组分析,通过荧光定量PCR验证差异基因表达,再通过发酵培养基优化考察高产菌株的发酵水平。结果 转录组分析表明,与低产菌株相比高产株中有1341个差异表达基因,GO注释表明DEGs主要参与氧化还原生物过程和脂质代谢及辅因子结合和辅酶结合,主要分布在甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、脂肪酸降解等通路。荧光定量PCR结果与转录组数据一致性达到100%。采用分别含有不同浓度的甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸的发酵培养进行筛选,多杀菌素发酵水平显著提高。结论 本研究通过新颖的转录组学方法获得了刺糖多孢菌高产菌株的差异基因,并对其高产机制和发酵优化进行了初步分析,为改良刺糖多孢菌菌株和优化发酵工艺提供重要的理论基础和参考依据。

基于Plackett-Burman设计的刺糖多孢菌培养条件优化

多杀菌素是新型生物源农药,系刺糖多孢菌的次级代谢产物。在单因子实验基础上,采用Plackett-Burman实验设计方法,优化了刺糖多孢菌培养条件。结果筛选出初始pH值、培养温度、摇瓶转速、摇瓶装液量4个因子,为本实验条件下影响刺糖多孢菌生物量的主效因子,4因子贡献率总和达90.8%,建立了回归模型Y=7.73-0.63x1+0.42x5-0.20x7+0.20x8,决定系数R2=0.9767,调整决定系数R2=0.9359,方差分析表明模型显著,生物量最大预测值可达9.18g/L。

植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响

为研究不同种类植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响,探索提高多杀菌素产量的方法,在发酵培养基中分别添加葵花油、花生油、大豆油、芝麻油、橄榄油和菜籽油,研究了其对菌体生长、脂肪酶活性和多杀菌素产量的影响,并利用RT-PCR对脂肪酶基因及多杀菌素合成相关基因的转录水平进行分析。结果表明:6种供试植物油对菌体生长和多杀菌素产量的影响程度不同,依次为菜籽油>橄榄油>花生油>芝麻油>葵花油>大豆油,其中菜籽油有利于诱导脂肪酶的表达、延缓菌体的衰亡和延长产素期,脂肪酶活力、菌体生物量和多杀菌素产量分别提高310.09%、8.97%和33.94%;脂肪酶基因和多杀菌素合成基因的转录强度也有明显提高。因此,菜籽油是其最佳的辅助性脂类碳源。

刺糖多孢菌bldD基因过表达对多杀菌素合成及其孢子形成的影响

bld D基因是链霉菌中的全局性调控基因,调节菌体的形态分化与次级代谢产物的合成。本研究采用重叠延伸PCR将bld D基因置于红霉素强启动子(Perm E)的控制下克隆至大肠杆菌-链霉菌穿梭载体p UC-spn上,构建重组载体p UC-spn-Perm E-bld D;通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中,获得遗传性能稳定的重组菌株S.spinosa-Bld D。平板培养观察发现,在BHI和TSB平板上,重组菌株的孢子形成受到明显抑制。摇瓶发酵结果显示,重组菌株多杀菌素产量相比对照菌株提高了1.35倍。因此,bld D基因的过量表达在一定程度上抑制刺糖多孢菌的孢子形成,并有效促进多杀菌素的生物合成,为研究其他正调控基因的过量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了重要基础。

遗传改造刺糖多孢菌菌株生产多杀菌素J和L

目的发展刺糖多孢菌遗传操作体系,构建生产多杀菌素J和L遗传重组菌株。方法由于刺糖多孢菌是公认的难操作放线菌之一,本文通过λ-Red和FLP重组酶介导的体内重组体系结合黏粒文库,发展了刺糖多孢菌的高效基因操作体系。结果利用该方法实现目标基因高效敲除,测试基因敲除效率可达66%。利用该技术构建了SpnK失活的刺糖多孢菌突变菌株,HPLCMS和NMR分析显示突变株产生的新化合物为多杀菌素J和L,且产量与出发菌株产生的多杀菌素A和D相当。结论该策略可用于刺糖多孢菌的遗传改造,可将多杀菌素高产菌株改造后直接生产多杀菌素J和L。

刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装

鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的2个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因(gtt、epi、gdh、kre)与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。为克隆到完整的多杀菌素生物合成基因簇,采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆gtt、epi、gdh和kre基因,并将其克隆组装在同一整合型载体上,以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成基因的表达载体。

GlnA基因对刺糖多孢菌生长发育及多杀菌素合成的影响

谷氨酰胺合成酶(GS,glutamine synthetase)是由Gln A基因编码的生物体中最古老也是最广泛存在的酶,它参与许多生物体中的氮和碳代谢,是生物体氮代谢的关键酶之一,对微生物的生命活动起着重要作用。本文研究了Gln A基因对刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的生长发育及次级代谢产物合成的影响,从刺糖多孢菌基因组中克隆了gln A基因的部分片段,将其与穿梭载体p OJ260连接,构建敲除载体p OJ260-gln A,通过接合转移将其导入刺糖多孢菌野生菌中,获得刺糖多孢菌敲除菌株S.spinosa-△gln A;同时,利用重叠延伸PCR将gln A基因置于红霉素强启动子Perm E下,并将融合片段Perm E-gln A与穿梭载体p OJ260进行酶切酶连,构建过量表达载体p OJ260-Perm E-gln A,通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中,获得了刺糖多孢菌过量表达菌株S.spinosa-gln A。表型分析发现,gln A基因的敲除对刺糖多孢菌的菌丝形态、孢子萌发等方面都有显著的抑制作用。HPLC检测分析发现,过量表达菌株中多杀菌素产量相比原始菌株提高到170%;该研究表明gln A基因对刺糖多孢菌的生长发育与多杀菌素的合成有一定的影响,为研究其在链霉菌次级代谢过程中的作用奠定了重要基础。

刺糖多孢菌分批发酵动力学研究

利用摇瓶培养试验研究了刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的分批培养过程中生物量、培养液pH、葡萄糖消长、多杀菌素含量等因素的变化规律。利用MATLAB软件对试验数据进行非线性回归，拟合出了细胞生长动力学模型、基质消耗动力学模型和产物生成动力学模型，得到了细胞生长量、残糖量、多杀菌素产量在发酵过程中随时间变化的规律，相关系数分别为0．98934、0．99266和0．98635．拟合曲线95％置信度区间分析的结果表明，该模型能够很好的反映出刺糖多孢菌分批发酵的过程．

利用山茶油提高刺糖多孢菌AEG3-1发酵多杀菌素生产

目的以诱变菌株Saccharopolyspora spinosa AEG3-1为试验株,研究山茶油对该菌株发酵生产多杀菌素的影响。方法首先单因素实验筛选到最佳植物油脂,再利用响应面实验设计对发酵培养基中最佳植物油脂、葡萄糖、糊精、棉籽蛋白4种成分进行优化,最后在5L罐进行验证。结果最佳植物油脂是山茶油,在0h添加15.0g/L效果最好。在此基础上,获得优化发酵培养基(g/L):山茶油15.1、葡萄糖51.6、糊精19.73、棉籽蛋白21.8,其产量达318.25mg/L,提高了55.61%。在5L罐中,利用优化培养基,分批和补料发酵产量分别达到361.97和512.36mg/L。结论通过添加山茶油,诱变株的多杀菌素产量显著提高,说明该生产工艺确实可行,可为多杀菌素大规模生产提供可靠的依据。

产多杀菌素刺糖多孢菌的诱变选育

目的采用甲基磺酸乙酯(EMS)、核糖体工程育种和常压室温等离子体(ARTP)方法处理产多杀菌素刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)SIIA-1802,采用含蛋氨酸培养基筛选得到高产菌株。方法首轮采用EMS诱变;第二轮采用链霉素抗性育种;第三轮采用ARTP诱变育种进一步巩固育种成效;采用对照和添加蛋氨酸的发酵培养基考察突变菌株的发酵水平。结果出发株刺糖多孢菌SIIA-1802经过EMS诱变、链霉素抗性筛选和ARTP诱变得到的突变株ESA-611,发酵水平提高了671.8%,采用含有蛋氨酸的发酵培养基进行筛选,发酵水平进一步提高了57.6%。在ARTP诱变过程中,筛选到一株多杀菌素A显著下降,但产生较高水平多杀菌素J的菌株ESA-598。结论本方法简单经济,突变效率高,能够快速获得传代稳定的多杀菌素高产突变株。另外,通过诱变拓宽了代谢产物谱,得到了具有更高潜在价值的组分。

基于转录组学分析刺糖多孢菌多杀菌素合成代谢途径关键酶基因挖掘

【目的】通过对不同时期的刺糖多孢菌进行转录组分析,探究多杀菌素生物合成的相关代谢通路,挖掘代谢途径关键酶基因,探究多杀菌素竞争基因簇,为高产工程菌的构建奠定基础。【方法】选取刺糖多孢菌株对数生长期(T2-48 h)和稳定期(T6-144 h)进行比较转录组分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)与转录组测序进行相互验证。采用基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)对差异表达基因进行功能和代谢通路注释并进行中心碳代谢分析。【结果】刺糖多孢菌通过转录组测序发现有2542个差异表达基因,其中具有显著上调基因1188个,显著下调基因1354个。GO注释表明,差异表达基因主要参与羧酸代谢过程、含氧酸代谢过程、有机酸代谢过程和氨基酸代谢过程。KEGG富集结果表明,差异表达基因主要参与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,以及氧化磷酸化和精氨酸生物合成等通路。进一步分析得到7个与多杀菌素生物合成相关的基因,其中accB、Pfk、G6PD、dsdA表达量显著上调,而涉及多杀菌素前体消耗的GAPDH、aceE、DLAT以及TCA循环和精氨酸生物合成途径中的基因表达量都呈现显著性下调趋势。qRT-PCR与转录组测序结果发现双方同时上调的基因有12个,分别为BGC2(43846 bp)、BGC4(18330 bp)、BGC9(20501 bp)、BGC18(62621 bp)、BGC22(19626 bp)、BGC25(42896 bp)、BGC26(40086 bp)、BGC28(39392 bp)、BGC30(20282 bp)、BGC31(53657 bp)、BGC34(20787 bp)和BGC35(40232 bp)。【结论】本研究通过转录组学分析获得了不同时期刺糖多孢菌的差异基因以及多杀菌素生物合成通路,并分析了刺糖多孢菌中多杀菌素的竞争基因簇,为后期开展多杀菌素生物合成途径的优化和对刺糖多孢菌进行遗传改造从而达到提高多杀菌素产量的目的奠定了基础。

复合诱变选育刺糖多孢菌高产菌株

多杀菌素是刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的一种大环内酯类抗生素。为提升刺糖多孢菌生产多杀菌素能力,本文通过对刺糖多孢菌工程菌SAS-004进行常压室温等离子结合抗性前体甘氨酸、紫外结合抗性前体丙酸钠和亚硝基胍结合抗性前体2-脱氧-D-葡萄糖三种方式选育,成功筛选到一株遗传稳定性良好的高产突变菌株809-5E,其多杀菌素产量相较于原始工程菌SAS-004提升1.14倍,与野生型菌株ATCC49460相比增加10倍,为工业化生产多杀菌素的菌株选育提供了重要参考。

亮氨酰氨肽酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及次级代谢产物合成的影响

【目的】构建亮氨酰氨肽酶基因(pep A)被阻断的刺糖多孢菌工程菌株,并鉴定该基因对刺糖多孢菌菌丝形态、生物量、菌体全蛋白表达水平及产多杀菌素能力的影响,探究该基因调控多杀菌素合成的可能机制。【方法】利用PCR扩增刺糖多孢菌中的pep A基因同源片段,经酶切连接技术构建敲除载体p OJ260-pep A;通过接合转移和单交换同源重组将该载体整合至刺糖多孢菌染色体中,获得工程菌株S.sp-△pep A;利用培养特征、形态学、高效液相色谱、SDS-PAGE等方法对菌株进行研究分析。【结果】工程菌株S.sp-△pep A菌丝片段化程度加剧,生长态势被延缓且生物量降低,但有效促进了多杀菌素的生物合成。阻断亮氨酰胺肽酶基因的表达使刺糖多孢菌菌体全蛋白表达情况发生明显改变,找到表达水平显著上调的差异蛋白核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶,核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长产生影响;醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A的合成酶相互作用影响辅酶A合成,而辅酶A是合成多杀菌素的重要底物。【结论】在刺糖多孢菌合成多杀菌素的次级代谢过程中,pep A基因作为负调控因子发挥作用。

透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成

为解决刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)高密度深层培养过程中的供氧不足问题,促进多杀菌素的生物合成,采用重叠PCR技术将透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)血红蛋白基因(vgb)可读框(ORF)置于红霉素抗性基因启动子(PermE)之下,并将其克隆到整合型载体pSET152上,构建成vgb表达载体pSET152EVHB;通过接合转移方式将其导入刺糖多孢菌SP06081中,利用载体上ΦC31整合性位点通过位点特异性重组将vgb定点整合到SP06081菌株染色体上,获得一株遗传性能稳定的重组菌株S078-1101;重组工程菌的PCR与Southern blotting检测显示vgb已整合到染色体上,一氧化碳结合差光谱分析表明在S078-1101工程菌中表达了有活性的透明颤菌血红蛋白(VHb);摇瓶发酵结果显示,在正常溶氧与中度限氧状态下,vgb的表达均可显著促进多杀菌素的生物合成(P<0.01).这说明vgb在刺糖多孢菌中的整合表达改善了菌体对溶氧的吸收性能,是一种有效的定向遗传改良手段.