绿豆胰蛋白酶抑制剂对蛋白质前体加工酶的抑制活性

目的:从绿豆中提纯天然的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI),并测定了它对前体加工酶的抑制活性。方法:通过硫酸铵沉淀、分子筛层析、离子交换、亲和层析和反相高压液相等一系列层析方法,纯化了MBTI;通过筛选得到两种蛋白质前体加工酶Kexin和Furin的高表达酵母菌株和COS-7细胞,用硫酸铵沉淀和分子筛的方法纯化这两种前体加工酶,并测定和计算MBTI对其的抑制活性。结果:纯化的MBTI在HPLC上洗脱为单峰,在SDS-PAGE中为单一条带。MBTI对Kexin的抑制常数达到3.9×10-9mol/L,对Furin有一定的抑制活性,但是抑制活性较弱。结论:MBTI对于Kexin和Furin两种蛋白前提加工酶都有抑制活性,尤其对Kexin抑制活性明显,如经进一步改造将有望成为理想的蛋白前体加工酶抑制剂。

LPS刺激对TACE基因表达和对TNF-α前体加工的影响

目的 :研究LPS刺激对肿瘤坏死因子转换酶 (TACE)基因转录和表达的影响及其与TNF α前体加工的关系。方法 :采用Dot blotting、Dot ELISA、间接免疫荧光和FACS等方法分别检测HL 6 0细胞在LPS刺激的不同时间段TACE、TNF α基因转录表达和膜分子分布情况。结果 :①HL 6 0细胞构成性高表达有活性TACE ,主要分布于细胞膜和核周边。②LPS刺激TNF α基因转录表达 ,但由于TACE的作用 ,膜TNF α(TM TNF α)下降 ,而分泌型TNF(sTNF α)增加 ;TACE的反义寡核苷酸 (ODN)显著抑制TNF α这种前体转换作用。③LPS同样刺激TACE基因表达增加 ,而且TACE酶解作用增强 ,但其蛋白表达和膜分子分布反而下降 ,推测TACE在发挥其催化膜蛋白作用后 ,其分子结构形式发生改变。结论 :炎症时分泌型TNF α增加不仅是该细胞因子基因表达增高所致 ,更受到TACE基因表达水平和活性状态的约束。

野生型和突变型小鼠前体mRNA加工因子31基因克隆及真核表达载体的构建

目的构建野生型和突变型小鼠前体mRNA加工因子31(pre-mRNA processing factor 31,PRPF31)基因的真核表达载体。方法通过逆转录聚合酶链反应(reverse tran-scriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增小鼠PRPF31野生型全长编码序列、体外定点突变获得331del12突变型PRPF31的cDNA编码序列,将上述两序列分别克隆入pGEM-T Easy载体,经限制性内切酶NheⅠ和EcoRⅠ双酶切后,再克隆入pTracer-CMV真核表达载体,予DNA测序鉴定。结果PCR成功扩增出野生型和突变型PRPF31基因,DNA序列分析证实两种基因的真核表达载体构建成功。结论野生型和突变型PRPF31基因真核表达载体的构建,为研究PRPF31基因突变引起视网膜色素变性的机制奠定了基础。

粟酒裂殖酵母tRNA前体3′末端加工酶Trz1p功能的研究

[目的]研究粟酒裂殖酵母tRNA前体3′末端加工酶Trz1p在体内的功能,为以后进一步探索Trz1p的功能奠定基础。[方法]构建Trz1+的表达载体pREP82x-trz1-5 flag,通过醋酸锂转化法将pREP82x-trz1-5 flag转入yYH1菌株和Trz1+的缺失菌株ySS0319中,并进行随机孢子分析。[结果]Trz1p C-端添加5FLAG仍能促进tRNA前体3′末端的加工成熟,但Trz1-5flag不能救活Trz1+的缺失菌株。[结论]粟酒裂殖酵母Trz1p具有tRNA前体3′末端加工功能。

核仁小分子RNA的结构、功能与合成

九十年代以来，许多新的核仁小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）陆续被发现。它们的大小一般在几十到几百个核苷酸，能与特定的蛋白质如核纤蛋白（ｆｉｂｒｉｌａｒｉｎ）或Ｔｈ／Ｔｏ自身免疫抗原等相结合生成ｓｎｏＲＮＰ，在细胞中稳定地存在，并且富集于核仁区。ｓｎｏＲＮ...

盐生盐杆菌在不同营养条件下紫膜蛋白形成的差异

用四种培养基培养产生紫膜极端嗜盐菌盐生盐杆菌（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｂｉｕｍ）菌株Ｒ１，通过超速离心和蔗糖密度梯度纯化紫膜，ＳＤＳ－ＰＧＡＥ后用考马斯亮蓝染色的结果显示其合成的紫膜蛋白的形式有所差异。从蛋白胨培养基上获得的紫膜有三条蛋白带，分子量约２６～２７５ｋＤ，而从复合培养基、合成培养基和人工海水培养基上获得的紫膜，仅呈现一条蛋白带，分子量约２６ｋＤ，即蛋白胨培养基上的成熟紫膜蛋白形式。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ的结果证明，在以上四种培养基上获得的纯化紫膜经ＳＤＳ－ＰＧＡＥ后考马斯亮蓝染色的条带确系紫膜蛋白，但还存在含量低于考马斯亮蓝染色灵敏度的紫膜蛋白带，从复合培养基、合成培养基和人工海水培养基所得紫膜在２８ｋＤ左右有一条浅带，但从蛋白胨培养基所得紫膜无此带；四种培养基所得紫膜在２３５ｋＤ左右都有一条浅带。可见。

Kex2p在甲醇酵母中的分泌表达

通过 PCR方法得到去除 C端 2 0 1个氨基酸残基 (胞浆区 ,跨膜区和 Ser/Thr丰富区 )的Kex2 p的 DNA片段 ,并将该片段装载到质粒 p PICZ- C中构建成表达质粒 p PICZ- C- KEX2 ΔCP。经过大肠杆菌 ( DH5 α)的扩增 ,表达质粒被转入甲醇酵母 ( GS1 1 5 )中 ,并得以分泌表达。发酵上清液中存在切割肽链中双碱性氨基酸 C端的酶活力。SDS- PAGE电泳的结果证实了 Kex2 p的分泌表达 ,以及 Kex2

The Nucleolus and Viral Infection

The nucleolus is a subnuclear structure of eukaryocytes. It was thought that nucleolus only participates in the biogenesis and processing of rRNA. However, more and more evidence shows that it has many other functions, such as tRNA precursor processing, stress sensing and it is also involved in gene silencing, senescence and cell cycle regulation. Here, we summarize the recent understandings about the nucleolar functions, the regulation of nucleolar localization of proteins and the role that the nucleolus plays in virus infection, in which some related studies of Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) US11, UL24 and bovine herpesvirus-1 infected cell protein 27 (BICP27) carried out in our lab will also be included.

Furin在宫颈癌变过程中的表达及其临床病理意义

Furin是蛋白前体加工酶家族中的重要成员，与肿瘤的转化、发展与转移密切相关。我们分别检测正常宫颈黏膜、宫颈上皮内瘤变（CIN）及宫颈癌组织中FurinmRNA及蛋白质的表达水平及酶活性，以探讨Furin与宫颈癌变的关系。