绿豆胰蛋白酶抑制剂对蛋白质前体加工酶的抑制活性

目的:从绿豆中提纯天然的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI),并测定了它对前体加工酶的抑制活性。方法:通过硫酸铵沉淀、分子筛层析、离子交换、亲和层析和反相高压液相等一系列层析方法,纯化了MBTI;通过筛选得到两种蛋白质前体加工酶Kexin和Furin的高表达酵母菌株和COS-7细胞,用硫酸铵沉淀和分子筛的方法纯化这两种前体加工酶,并测定和计算MBTI对其的抑制活性。结果:纯化的MBTI在HPLC上洗脱为单峰,在SDS-PAGE中为单一条带。MBTI对Kexin的抑制常数达到3.9×10-9mol/L,对Furin有一定的抑制活性,但是抑制活性较弱。结论:MBTI对于Kexin和Furin两种蛋白前提加工酶都有抑制活性,尤其对Kexin抑制活性明显,如经进一步改造将有望成为理想的蛋白前体加工酶抑制剂。

Kex2p在甲醇酵母中的分泌表达

通过 PCR方法得到去除 C端 2 0 1个氨基酸残基 (胞浆区 ,跨膜区和 Ser/Thr丰富区 )的Kex2 p的 DNA片段 ,并将该片段装载到质粒 p PICZ- C中构建成表达质粒 p PICZ- C- KEX2 ΔCP。经过大肠杆菌 ( DH5 α)的扩增 ,表达质粒被转入甲醇酵母 ( GS1 1 5 )中 ,并得以分泌表达。发酵上清液中存在切割肽链中双碱性氨基酸 C端的酶活力。SDS- PAGE电泳的结果证实了 Kex2 p的分泌表达 ,以及 Kex2