前内皮素原mRNA在新生鼠肺出血发生过程中肺内的表达及作用

目的探讨前内皮素原mRNA(preproendothelin-1 mRNA,ppET-1mRNA)在新生鼠肺出血发生过程中肺组织中的表达。方法生后7～8d的Wister新生鼠,随机分为空气组(C)、低氧组(H)、低温缺氧组(HH)、低温缺氧后常氧复温组(HHR)、低温缺氧后高氧复温组(HHRO2)。C组置常温室内,H组置低氧箱内6h,吸入氧气浓度5%～6%,HH组同H组,并置于(10±1℃)冰箱内6h,HHR组低温缺氧过程同HH组,随后常氧下复温2h,HHRO2组同HHR组但复温时吸入气氧浓度>95%。各组取肺组织,观察肺大体,切片HE染色观察肺组织病理学改变,逆转录——聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺组织中ppET-1mRNA表达。结果H组、HH组、HHR组和HHRO2组肺大体均呈现水肿,HH组、HHR组和HHRO2组可见点状、局灶性至弥漫性出血;光镜下组织学改变包括肺水肿(肺泡及间隔水肿)、肺泡扩大、间隔断裂、肺泡融合及出血,HHRO2组最严重;ppET-1mRNA在H组、HH组、HHRO2组表达量增高(分别为0.706±0.184、0.641±0.172、0.673±0.246),与C组(0.363±0.216)比较P均<0.01。结论在新生鼠肺出血发生过程中,肺组织中ppET-1mRNA呈高表达状态,在肺出血发生过程中起了重要的作用。

内皮细胞特异性表达血管内皮生长因子基因载体的构建及表达特性验证(英文)

目的构建在内皮细胞特异性表达人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的真核表达载体,验证HRE.ppET-1调控元件的内皮细胞表达特异性。方法用聚合酶链反应(PCR)方法直接合成缺氧反应元件(hypoxia-responsive element,HRE),人前内皮素原-1基因(human preproendothe-lin-1,ppET-1)启动子、VEGF元件,通过PCR、酶切、连接等一系列核酸分子操作,将各元件亚克隆至pcD-NA3.1载体上,最终组合而成真核表达载体pcDNA3.1-VEGF+Pa,pcDNA3.1(-CMV)-ppET-1+VEGF+Pa,pcDNA3.1(-CMV)-HRE+ppET-1+VEGF+Pa;脂质体转染离体培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)和肝细胞,荧光显微镜下观察GFP表达,验证HRE.ppET-1调控元件在内皮细胞中的特异性。结果各载体经酶切鉴定和测序证实。GFP的表达显示HRE.ppET-1调控元件在内皮细胞中可有效转录外源基因,在非内皮细胞中表达极弱。结论成功构建能在内皮细胞特异性表达人VEGF基因的真核表达载体;HRE.ppET-1调控元件具有内皮细胞表达特异性,为进一步利用VEGF进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定良好基础。

HRE.ppET-1调控血管内皮生长因子基因在内皮细胞的靶向性表达

试图探讨缺氧反应元件(hypoxia-responsive element,HRE)增强人前内皮素原-1基因(human preproendothelin-1,ppET-1)启动子在缺氧条件下靶向调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因在内皮细胞中的表达,以提高基因治疗的效果.构建真核表达载体pEGFP-HRE.ppET-1,pcDNA3.1-VEGF+Pa(VA),pcDNA3.1-ppET-1+VEGF+Pa(PVA),pcDNA3.1-HRE.ppET-1+VEGF+Pa(HPVA),脂质体转染离体培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)和肝细胞,荧光显微镜下观察GFP表达,验证HRE.ppET-1调控元件在内皮细胞中的特异性.培养基中加入100μmol/L的氯化钴模拟细胞体外缺氧环境.载体转染后,RT-PCR和Western blot半定量分别检测各载体VEGFmRNA和蛋白水平在常氧及缺氧条件下的表达差异.应用Elisa定量检测细胞上清VEGF蛋白的表达量,分析各载体的表达水平.使用MTT实验检测细胞增殖率.GFP的表达显示HRE.ppET-1调控元件在内皮细胞中可有效转录外源基因,在非内皮细胞中表达极弱.RT-PCR,Western Blot及Elisa的检测结果均表明缺氧条件下HPVA组以及PVA组中,VEGF的表达均较常氧条件下增强(P<0.05).MTT实验检测显示HPVA转染的缺氧条件下的HUVEC增殖率超过其常氧未转染对照组.结果显示,HRE.ppET-1调控元件具有内皮细胞表达特异性,并能在缺氧条件下显著提高VEGF的表达,刺激内皮细胞的增殖,为进一步开展内皮细胞的靶向基因治疗研究奠定良好基础.