TET2重塑CXCR4 DNA甲基化对急性心肌梗死小鼠心肌组织自噬、炎症反应及凋亡的影响

目的:探究急性心肌梗死(AMI)过程中内皮细胞tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)对趋化因子受体4(CXCR4)DNA甲基化的影响以及对AMI小鼠心肌组织自噬、炎症反应及组织细胞凋亡的影响机制,为临床探究AMI发展的分子机制提供理论依据。方法:8周龄雄性C57/BL6小鼠50只,制备AMI模型,尾部注射TET2、CXCR4过表达质粒;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测心肌组织TET2、CXCR4、微管相关蛋白3(LC3)、P62、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)关联X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2表达;甲基化检测CXCR4 DNA甲基化水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌组织内炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测各组心肌组织细胞凋亡指数。结果:与假手术组比较,模型组心肌组织内TET2、CXCR4均表达上调,TET2、CXCR4均在心肌组织内过表达,TET2过表达促进CXCR4表达,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,TET2 mimic组CXCR4启动子区域DNA甲基化程度降低,CXCR4蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与假手术组比较,模型组小鼠心肌组织自噬蛋白LC3、抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2表达下调,炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平、自噬蛋白P62、促细胞凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);TET2、CXCR4过表达进一步下调LC3、Bcl-2蛋白表达,上调炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平,P62、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达;TET2、CXCR4二者联合体现出最低LC3、Bcl-2蛋白表达,最高炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平以及P62、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AMI发展中,TET2通过降低CXCR4 DNA甲基化,促进CXCR4基因表达,进而抑制AMI小鼠心肌组织自噬,上调炎症反应及细胞凋亡程度,促进疾病发展。

新生儿缺氧缺血性脑病外周血淋巴细胞中前列腺凋亡反应基因4mRNA检测的临床意义

目的探讨测定新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)外周血淋巴细胞中前列腺凋亡反应基因4(Par4)mRNA表达量的临床意义。方法HIE患儿37例为实验组(轻度14例,中度15例,重度8例),正常新生儿8例为对照组。两组在生后24h抽取外周静脉血1mL,采用Rt PCR法测定淋巴细胞中Par4mRNA表达量。结果轻、中、重度HIE患儿外周淋巴细胞中Par4mRNA表达量均较对照组显著上调(P均<0.01)。重度HIE患儿Par4mRNA表达量最高(F=64.6P<0.01)。结论测定外周血淋巴细胞中Par4mRNA表达量,对HIE的早期诊断和疾病严重程度的判断有一定临床价值。

A20突变体对前列腺癌细胞炎症反应因子及凋亡抑制基因表达的影响

目的通过构建A20突变体真核载体,获取A20突变体,研究其对前列腺癌细胞PC-3M细胞炎症反应因子及凋亡抑制基因表达的影响。方法构建A20突变体pEGFP-C1表达载体,提取质粒,限制性内切酶酶切鉴定并测序。质粒DNA转染COS7细胞,用LPS诱导PC-3M细胞产生炎症反应,利用Western blot法检测PC-3M细胞A20,IκB-α、pERK1/ERK2、pJNK、Bcl-2;利用ELISA检测NF-κB、TNF-α、IL-6等的水平。结果限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实合成A20突变体真核载体寡核苷酸链插入正确。Western blot检测结果表明转染后PC-3M细胞A20蛋白表达显著增。A20突变体抑制IκB-α的降解,ERK1/ERK2、JNK磷酸化及凋亡抑制基因Bcl-2的表达。ELISA法检测结果表明,A20突变体能显著抑制NF-κB、TNF-α、IL-6的表达(P<0.05,P<0.01)。结论成功构建人A20突变体真核表达载体,A20突变能抑制炎症反应因子及凋亡抑制基因。

β-淀粉样肽(25-35)对PC12细胞前列腺凋亡反应蛋白-4和bcl-2基因表达的影响

目的观察β-淀粉样肽(25—35)(β-amyloidpeptide25—35,Ap25-35)诱导PC12细胞凋亡及对前列腺凋亡反应蛋白-4(prostateapoptosisresponse-4,par-4)和bel-2基因表达的影响。方法采用MTT比色法分析细胞存活率,Hoechst33258-PI荧光染色观察细胞核凋亡的形态学改变,RT—PCR检测par-4和bcl-2基因mRNA表达变化,Westernblot检测Par-4和Bcl-2蛋白表达变化。结果随Aβ25-35浓度的增加,PC12细胞存活率降低,荧光染色可见细胞核固缩、核碎裂,par-4mRNA及蛋白表达增加,bcl-2mRNA及蛋白表达降低。结论在Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡过程中Par-4和Bcl-2蛋白分子可能起重要作用。

过表达前列腺凋亡反应因子-4对NIT-1细胞的影响

目的:构建携带前列腺凋亡反应因子-4(prostate apoptosis response-4,PAR-4)基因PRKC apoptosis WT1 regulator(pawr)表达的重组腺病毒载体,研究PAR-4对胰岛β细胞株NIT-1的影响。方法:利用Oligo Designer3.0设计Pawr模版引物,通过RT-PCR扩增出pawr基因片段,使用双酶切克隆至腺病毒载体ADV1,构建重组载体质粒p Ad Track-pawr-CMV。线性化p Ad Track-pawr-CMV和p Ad-Easy-1共同转化到感受态大肠杆菌构建重组腺病毒载体质粒p Ad Track-pawr。将NIT-1细胞分为4组:低糖组、高糖对照组、低糖+PAR-4过表达组以及高糖+PAR-4过表达组,Western blot检测各组PAR-4蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖能力,ELISA检测经葡萄糖刺激后的各组细胞胰岛素分泌功能。结果:克隆的pawr基因片段测序正确。高纯度质粒中量抽提试剂盒抽提重组腺病毒载体质粒成功,单酶切鉴定,质粒转染HEK293细胞后有GFP表达,扩增48 h后出现细胞病变效应,病毒滴度测定为1×109 pfu/ml,低糖和高糖过表达PAR-4后均较相应对照组PAR-4表达明显升高,高糖培养+过表达PAR-4组细胞增殖能力均较低糖(P=0.000)和高糖对照组细胞(P=0.000)明显下降,较低糖(P=0.003)和高糖对照组细胞(P=0.001)胰岛素分泌明显下降。结论:成功构建高滴度pawr基因表达的重组腺病毒载体并转染NIT-1细胞,转染PAR-4后高糖培养的NIT-1细胞增殖能力和胰岛素分泌功能明显下降。

黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎小鼠TLR4/NF-κB信号通路和细胞凋亡的影响

目的:探究黄芪总黄酮(TFA)对柯萨奇B3病毒(CVB3)诱导的病毒性心肌炎(VMC)小鼠模型Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路和细胞凋亡的影响。方法:将40只小鼠随机分为对照组、VMC组、VMC+低剂量TFA组、VMC+高剂量TFA组,每组10只。VMC组、VMC+低剂量TFA组、VMC+高剂量TFA组经CVB3诱导建立VMC小鼠模型,VMC+低剂量TFA组、VMC+高剂量TFA组分别以15、30 mg/kg TFA灌胃,VMC组、对照组以等量生理盐水灌胃。CVB3感染后第11天超声检查小鼠心脏功能,处死小鼠后采用苏木精-伊红(HE)染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色观察心肌形态学变化和凋亡情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测心肌组织匀浆液中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌组织中TLR4、NF-κB p65(p65)、磷酸化NF-κB p65(p-p65)、切割后半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-Caspase-3)、切割后半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved-Caspase-9)表达。结果:与对照组比较,VMC组小鼠CVB3 mRNA、左室收缩末期内径(LVESD)、心肌细胞凋亡率、心肌组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相对表达量明显升高,左室射血分数(LVEF)明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与VMC组比较,VMC+低剂量TFA组和VMC+高剂量TFA组CVB3 mRNA、LVESD、心肌细胞凋亡率、心肌组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相对表达量明显降低,LVEF明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);MC+高剂量TFA组CVB3 mRNA、IL-6、TNF-α水平,细胞凋亡率,TLR4、p-p65/p65和Cleaved-Caspase-9相对表达量明显低于VMC+低剂量TFA组,LVEF明显高于MC+低剂量TFA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:TFA可减轻CVB3诱导的VMC小鼠心肌病理损伤,减少心肌炎症反应和细胞凋亡,其作用机制与TLR4/NF-κB信号通路、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9表达的抑制有关。

前列腺凋亡反应蛋白-4在神经退行性疾病发病机制作用的研究进展

中枢神经退行性疾病主包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）及肌萎缩型侧索硬化症（ALS）等。在AD、PD、HD、ALS等神经退行性疾病的动物或患者的尸检中发现前列腺凋亡反应蛋白（Par）-4升高,阻断这些疾病中Par-4的表达能抑制神经元的死亡,表明Par-4在神经系统退行性疾病中起关键作用。

鼻咽癌放疗过程中前列腺凋亡反应因子的表达及意义

目的探讨前列腺凋亡反应因子(Par-4)对鼻咽癌放疗敏感性的意义。方法对40例初治、无远处转移的鼻咽癌患者分别于放疗前、放疗中(40Gy)、放疗后(70Gy)取活检标本,并将10例慢性鼻咽炎患者作为对照,用SP法检测各组前列腺凋亡反应因子蛋白的表达水平,并用SPSS13.0分析数据。结果鼻咽癌组织中前列腺凋亡反应因子蛋白的表达与放疗时间剂量成正相关(r=0.46,P<0.05),与患者年龄、性别无关。结论前列腺凋亡反应因子可作为预测鼻咽癌临床放射敏感性的指标。

siRNA靶向沉默B7-H4基因对人前列腺癌DU145细胞增值和凋亡的影响

目的研究siRNA沉默B7-H4基因对人前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的影响。方法以脂质体Lipofectami-neTM2 000(Lipo)为载体转染siRNA-B7-H4至DU145细胞,应用RT-PCR和Western Blot检测B7-H4表达水平,CCK-8法检测细胞增殖的变化,Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与空白组和阴性对照组(NC)相比,转染B7-H4-siRNA的细胞B7-H4 mRNA和蛋白表达明显减少(P<0.05),DU145转染B7-H4 siRNA后,增殖能力减弱,凋亡显著。结论通过B7-H4-siRNA抑制DU145细胞B7-H4的表达,可以抑制细胞增殖,促进其凋亡,表明B7-H4在前列腺癌的发生发展中发挥重要作用。

艾拉莫德通过TLR4/NF-κB通路抑制骨关节炎软骨细胞模型凋亡及炎症反应

目的研究艾拉莫德对骨关节炎(OA)软骨细胞模型凋亡及炎症反应的调控作用及机制。方法培养软骨细胞株ATDC5,采用10 ng/mL白细胞介素(IL)-1β刺激的方法建立OA软骨细胞模型,给予不同浓度(0.6、1.2、1.8 mg/L)艾拉莫德处理,转染pcDNA质粒或pcDNA-Toll样受体4(TLR4)质粒。检测细胞增殖活力(以A_(490)表示)、凋亡率,裂解型caspase-3(Cleaved caspase-3)、TLR4、核因子-κB(NF-κB)p-p65表达水平,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8水平。结果模型组A_(490)低于对照组,凋亡率、Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p-p65、TNF-α、IL-6、IL-8水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度艾拉莫德组A_(490)高于模型组,凋亡率、Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p-p65、TNF-α、IL-6、IL-8水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)且上述调控作用呈浓度依赖性;在转染质粒的条件下,pcDNA-TLR4+1.8 mg/L艾拉莫德组A_(490)低于pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德组,凋亡率、Cleaved caspase-3、TLR4、NF-κB p-p65、TNF-α、IL-6、IL-8水平均高于pcDNA+1.8 mg/L艾拉莫德组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论艾拉莫德通过抑制TLR4/NF-κB通路改善OA软骨细胞模型的凋亡及炎症反应。

电针结合金匮肾气丸对良性前列腺增生大鼠前列腺中凋亡调控因子的影响

良性前列腺增生（BPH）是临床常见疾病,严重威胁老年男性的身心健康。目前其病因病机尚未完全阐明,近年来,研究发现细胞凋亡与BPH的发生发展密切相关。Bcl-2和Bax是重要的凋亡调控基因,二者表达异常与BPH的发生密切相关。

lncRNA SNHG1靶向miR-145-5p/PDCD4轴对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)核内小RNA宿主基因1(SNHG1)靶向miR-145-5p/程序性细胞死亡因子4(PDCD4)轴对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法将H9c2细胞分为对照组(NC组)、H/R组、si-NC组、si-SNHG1组、mimic NC组、miR-145-5p mimic组、si-SNHG1+inhibitor NC组、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor组。除NC组外,其他组H9c2细胞均需转染对应物质后构建H/R模型。实时定量PCR(qRT-PCR)检测H9c2细胞中SNHG1、miR-145-5p表达;CCK-8法、流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡;试剂盒检测H9c2细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量;Western blotting检测H9c2细胞中PDCD4、caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证SNHG1与miR-145-5p、miR-145-5p与PDCD4的关系。结果沉默SNHG1或过表达miR-145-5p可促进H/R诱导的H9c2细胞中miR-145-5p表达和细胞增殖,抑制PDCD4蛋白表达、细胞凋亡和氧化应激。miR-145-5p inhibitor减弱了沉默SNHG1对H/R诱导的H9c2细胞中miR-145-5p表达和细胞增殖的促进作用,以及对PDCD4蛋白表达、细胞凋亡、氧化应激的抑制作用。SNHG1靶向调控miR-145-5p/PDCD4轴。结论沉默SNHG1可能通过调控miR-145-5p/PDCD4轴抑制H/R诱导的H9c2细胞凋亡。

程序性细胞死亡因子4基因对川崎病血清诱导血管内皮细胞凋亡的影响

目的研究程序性细胞死亡因子4(PDCD4)对川崎病病人血清诱导的血管内皮细胞凋亡的作用。方法研究时间为2017年3月至2018年4月。采集邵阳学院附属第一医院川崎病病人血清,处理血管内皮细胞,实时荧光定量PCR(realtime PCR)和蛋白质印迹法检测细胞中PDCD4 mRNA和蛋白表达水平。在血管内皮细胞中转染PDCD4 siRNA,用川崎病血清培养,以Realtime PCR和蛋白质印迹法检测细胞中PDCD4表达水平。MTT方法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞中活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(C-Caspase-3)、活化型Caspase-9(C-Caspase-9)蛋白水平。结果川崎病病人血清处理后的血管内皮细胞中PDCD4表达上调[mRNA:(1.00±0.01)比(3.51±0.36);蛋白:(0.26±0.08)比(0.57±0.06)]。PDCD4 siRNA可以下调川崎病病人血清诱导的血管内皮细胞中PDCD4表达水平[mRNA:(0.91±0.09)比(0.41±0.06);蛋白:(0.65±0.08)比(0.30±0.05)]。川崎病病人血清处理后的血管内皮细胞增殖能力降低[(100.00±0.00)%比(72.01±7.32)%],细胞凋亡率升高[(6.32±0.58)%比(21.26±2.31)%],细胞中的C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平升高。下调PDCD4可以提高川崎病血清条件下血管内皮细胞增殖能力[(71.57±9.05)%比(89.52±6.80)%],减少细胞凋亡[(22.58±1.79)%比(16.47±1.24)%]和细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白表达。结论下调PDCD4减少川崎病病人血清诱导的血管内皮细胞凋亡。

微小RNA-7-5p靶向调节锌指蛋白核转录因子4基因抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的探讨微小RNA(miR)-7-5p对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡及锌指蛋白核转录因子4(KLF4)基因表达调控的影响。方法研究起止时间为2018年3-10月。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-7-5p在人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF及口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量。将miR-7-5p模拟物(miR-7-5p mimics)及阴性对照序列(mimics Control)分别转染至SCC25细胞,分为三组:Control组(未转染的SCC25细胞)、NC组(转染mimics Con-trol的SCC25细胞)、miR-7-5p组(转染miR-7-5p mimics的SCC25细胞)。以qRT-PCR检测miR-7-5p在SCC25细胞中的转染效果;MTT法检测miR-7-5p对SCC25细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-7-5p对SCC25细胞凋亡的影响;通过双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blotting)检测miR-7-5p对KLF4的靶向关系。结果miR-7-5p在3种口腔鳞状细胞癌细胞SCC25、Cal127和Tca8113中的表达量[(0.21±0.02)、(0.43±0.04)、(0.48±0.05)]明显低于人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF(1.00±0.09)(P<0.05);转染miR-7-5p mimics能够上调SCC25细胞中miR-7-5p的表达(P<0.05);miR-7-5p过表达能够明显抑制SCC25细胞增殖能力[Control组、NC组72 h吸光度(1.43±0.13)、(1.46±0.15)比miR-7-5p组(0.81±0.09)](P<0.05),并诱导细胞凋亡[Control组、NC组凋亡率(9.48±2.65)%、(10.21±3.02)%比miR-7-5p组(24.41±8.15)%](P<0.05);双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-7-5p过表达可抑制KLF4-Wt报告基因载体细胞相对荧光活性;qRT-PCR和Western blotting进一步证实了miR-7-5p能够靶向调节KLF4 mRNA和蛋白表达。结论miR-7-5p直接靶向调控KLF4基因的表达来抑制口腔鳞状细胞癌SCC25细胞增殖,诱导细胞凋亡。

TGF-β1和Smad4基因转染对子宫内膜癌细胞HHUA体外增殖和凋亡的研究

目的:探讨TGF-β1和Smad4基因转染对子宫内膜癌细胞HHUA体外增殖、细胞周期、凋亡及Smad7、PAI-1的影响。方法:电穿孔法将Smad4基因转染入HHUA细胞。观察未转染和转染Smad4基因的HHUA细胞在不同浓度TGF-β1(0,2.5,5,10ng/ml)培养液中其Bcl-2、Bax、Smad7、PAI-1的表达、肿瘤细胞增殖活性和凋亡活性变化及Smad7、PAI-1和TGF-β1 mRNA水平。结果:TGF-β1以时间依赖方式明显抑制HHUA生长(P<0.05),各浓度组间无显著差异;转染Smad4后TGF-β1仍明显抑制HHUA生长(P<0.01)。转染Smad4前后,TGF-β1均阻滞细胞停滞于G1期;转染后作用增强,差异有统计学意义(P<0.01)。TGF-β1明显降调Bcl-2,升调Bax、Smad7和PAI-1表达,促进细胞凋亡;转染Smad4后作用增强(P<0.05)。TGF-β1、Smad7和PAI-1 mRNA水平在TGF-β1作用和(或)Smad4转染前后都明显升高。结论:TGF-β1以时间依赖方式抑制HHUA体外增殖,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡;转染Smad4明显增强了TGF-β1的抗肿瘤作用。

miR-21靶向CCL20及PDCD4对脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡及炎症反应的调节作用

目的:研究miR-21靶向CC趋化因子配体20(CCL20)及程序性细胞死亡因子4(PDCD4)对脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡及炎症反应的调节作用。方法:成年雄性SD大鼠随机分为对照组、脓毒症组、脓毒症+NC组、脓毒症+miR-21组,后三组采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症模型,尾静脉注射NC mimic或miR-21 mimic进行干预,48 h后检测血清中肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量、心肌HE染色、细胞凋亡率、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及IL-1β含量、CCL20及PDCD4表达;培养心肌H9c2细胞,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与CCL20及PDCD4基因mRNA 3’UTR的靶向关系。结果:与对照组相比,脓毒症组大鼠心肌中miR-21表达明显减少,血清cTnⅠ、CK-MB含量及心肌中细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β含量、CCL20、PDCD4表达均明显提高(P<0.05);与脓毒症组相比,脓毒症+miR-21组心肌中miR-21表达明显增加,血清cTnⅠ、CK-MB含量及心肌中细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β含量、CCL20、PDCD4表达均明显降低(P<0.05)。miR-21组H9c2细胞CCL20、PDCD4表达及CCL20、PDCD4双荧光素酶报告基因荧光活力均明显低于NC组(P<0.05)。结论:miR-21可抑制脓毒症大鼠心肌中细胞凋亡及炎症反应,其分子机制可能为靶向抑制CCL2及PDCD4表达。

miR-203-5p靶向调控ERBB4基因参与子宫内膜癌细胞凋亡

目的探究microRNA-203-5p(miR-203-5p)靶向调控H编码人表皮生长因子受体4的癌基因(oncogene encoding human epidermal growth factor receptor 4,ERBB4)对子宫内膜癌小鼠细胞凋亡的影响和作用机制。方法随机选取18只SPF级雄性C57/BL6小鼠,依据随机数字表法将其分为常规组和模型组,构建子宫内膜癌小鼠模型;TargetScan预测miR-203-5p靶基因;构建ERBB4的siRNA表达载体;免疫组化检测ERBB4表达情况;将传代培养后取对数期细胞用于实验,将细胞分为Blank组、Negative control (NC)组、miR-203-5p mimic组、miR-203-5p inhibitor组、si-ERBB4组、miR-203-5p mimic+si-ERBB4组;采用MTT法测定各组细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;采用RT-PCR法和western blot法测定相关mRNA和蛋白表达量。结果 miR-203-5p靶向ERBB4;miR-203-5p在子宫内膜癌小鼠子宫内膜组织中为低表达,ERBB4为高表达;与Blank组相比,miR-203-5p mimic+si-ERBB4组细胞凋亡率上升且增殖明显抑制,miR-203-5p inhibitor组结果相反;与Blank组相比,miR-203-5p表达在miR-203-5p mimic组和miR-203-5p mimic+si-ERBB4组中上升,在miR-203-5p inhibitor组中结果相反;与Blank组相比,在miR-203-5p inhibitor组中bcl-2表达上升而bax、Caspase-3下降,在miR-203-5p mimic组、si-ERBB4组和miR-203-5p mimic+si-ERBB4组中结果相反;与Blank组相比,ERBB4 mRNA及蛋白表达在miR-203-5p mimic组、si-ERBB4组和miR-203-5p mimic+si-ERBB4组下降。结论 miR-203-5p在子宫内膜癌小鼠子宫内膜组织中低表达,ERBB4高表达。诱导miR-203-5p表达,可以通过靶向下调ERBB4基因,上调bax、Caspase-3表达并下调bcl-2表达,从而抑制其细胞侵袭,诱导其发生凋亡。

Par-4基因在PC12细胞缺氧后的表达及其反义寡核苷酸的抗凋亡作用

目的研究前列腺凋亡反应基因4(Par4)在PC12细胞缺氧后的表达及其反义寡核苷酸(ASODN)的抗凋亡作用。方法在正常或缺氧条件下培养PC12细胞,分组将不同浓度Par4反义寡核苷酸转染PC12细胞,吖啶橙/溴化乙锭荧光染色观察PC12细胞形态,流式细胞分析评价凋亡百分率。Westernblot测定Par4蛋白表达量,比色法检测Caspase3的酶活性。结果缺氧24h,PC12细胞中Par4蛋白表达量上调157.42±7.53,明显高于正常对照组10.51±3.36(P<0.01)。10μmol/L的Par4,ASODN使Par4蛋白降为31.79±3.09,明显低于缺氧组157.42±7.53(P<0.01)。Par4的ASODN抑制缺氧诱导的PC12细胞凋亡,10μmol/LASODN使细胞凋亡百分数降为(34.5±3.5)%,明显低于缺氧组的(69.3±5.7)%(P<0.05)。Par4的ASODN抑制缺氧诱导的PC12细胞中Caspase3的酶活性上调,10μmol/LASODN使其活性降为0.549±0.078,与缺氧组0.917±0.051相比,差别有显著性意义(P<0.05)。结论Par4基因可能参与了缺氧诱导的PC12细胞损害。Par4ASODN可拮抗缺氧诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与Caspase3酶活性下调有关。

Krppel样因子4过表达对热应激所致C2C12细胞凋亡的影响

目的探讨Krppel样因子4对热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡的影响。方法采用热应激(42.5℃)处理Krppel样因子4过表达的C2C12细胞1h,37℃恢复12h;采用流式细胞术、Hoechst33258染色检测细胞凋亡;采用Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达。结果流式细胞术结果发现,两组细胞凋亡百分率较热应激前均升高,但与转空载体组相比较Krppel样因子4过表达组升高更明显,凋亡百分率达19.6%;荧光染色可见细胞出现核固缩、凋亡小体等凋亡形态学改变;Krppel样因子4组细胞经Western blot能检测到bcl-2、bax蛋白明显改变。结论Krppel样因子4可以诱导热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的 获取抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRARAIL)抗体。方法 利用PCR技术和基因重组技术将TRAIL基因构建于原核表达载体pPre-TMHTb中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过IPTG诱导其在大肠杆菌DH-5α中获得表达,并将TRAIL蛋白免疫家兔,通过DotBlot及 Western Blot检测抗 TRAIL抗体的产生。结果 成功构建TRAIL基因原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,TRAIL蛋白表达量占菌体蛋白质总量的11.8％,经Dot Blot及 WesternBlot捡测证实获得了抗TRAIL抗体。结论 成功制备抗TRAIL抗体,从而为TRAIL在真核细胞水平的深入研究奠定了实验基础。