RNA干扰Id2基因表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力

背景:Id基因是碱性螺旋-环-螺旋因子的内源性负性调节因子。该因子参与细胞的增殖、分化和生存,并在不同类型肿瘤的进展和浸润过程中表现出功能的多样性。目的:探讨沉默Id2基因表达对人前列腺肿瘤干细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:取对数生长期的PC-3人前列腺癌细胞,采用无血清悬浮培养法分离肿瘤干细胞球,流式细胞仪检测肿瘤干细胞表面标记CD44^+CD24^-表达。构建sh RNA-Id2表达载体,转染至前列腺肿瘤干细胞,以未转染的前列腺肿瘤干细胞为对照。转染后48 h,采用RT-PCR与Western blot实验检测前列腺肿瘤干细胞Id2基因及蛋白的表达;采用MTT法、Transwell小室检测前列腺肿瘤干细胞的增殖和侵袭能力;采用Western blot与RT-PCR检测前列腺肿瘤干细胞上皮标志物E-钙黏蛋白、间质细胞标志物波形蛋白及上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist的表达。结果与结论:(1)采用无血清悬浮培养法成功分离出肿瘤干细胞球,第3代前列腺肿瘤干细胞表面标记CD44^+CD24^-表达率为(85.69±8.96)%,显示培养的肿瘤干细胞球高表达肿瘤干细胞表型;(2)转染后48h,sh RNA-Id2转染组细胞Id2基因及蛋白表达明显低于未转染组(P <0.05),显示成功干扰了前列腺肿瘤干细胞Id2表达;(3)shRNA-Id2转染组前列腺肿瘤干细胞的增殖速度和侵袭能力低于未转染组(P<0.05);(4)sh RNA-Id2转染组前列腺肿瘤干细胞的上皮标志物E-钙黏蛋白表达高于未转染组(P<0.05),间质细胞标志物波形蛋白、上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist表达低于未转染组(P <0.05);(5)结果表明,RNA干扰Id2基因表达可通过调控E-钙黏蛋白、波形蛋白及Twist表达抑制前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力。

联合应用MS-275和MDV3100对前列腺肿瘤干细胞样微球的作用

目的:探讨雄激素受体(androgen receptor,AR)拮抗剂和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂对前列腺肿瘤干细胞样微球的作用,并探讨其可能的分子机制。方法:采用无血清悬浮培养前列腺LNCaP和22RV1肿瘤细胞以获取干细胞样肿瘤微球细胞,然后单独和联合使用AR拮抗剂MDV3100和HDACⅠ类抑制剂MS-275分别处理2种微球细胞,镜下观察细胞形态,评估其克隆形成能力。应用实时荧光定量聚合酶链反应检测微球细胞中CD133的转录水平,Western blot检测DNA损伤标志物磷酸化H2A.X(p-H2A.X)的表达和细胞凋亡标志蛋白聚ADP-核糖聚合酶(PARP)特异性裂解片段的水平,同时检测Wnt信号通路关键分子β-catenin以及原癌基因c-Myc、cyclin D1蛋白表达情况。结果:MDV3100单独处理能明显降低肿瘤干细胞标志物CD133的表达;而MS-275单独或联合MDV3100处理均能明显抑制肿瘤干细胞样肿瘤微球的形成、降低肿瘤微球细胞CD133的表达,并促进肿瘤微球细胞产生PARP的特异性裂解,使p-H2A.X表达水平升高,同时可以明显降低β-catenin、c-Myc及cyclin D1的表达。结论:联合应用MS-275和MDV3100可以显著增强MDV3100的抗肿瘤活性,具体表现在抑制肿瘤干细胞样微球细胞生成及克隆形成、损伤细胞的DNA、诱导细胞凋亡等。该结果为临床联合应用HDACⅠ类抑制剂MS-275和AR拮抗剂MDV3100治疗前列腺肿瘤提供了一定的实验依据。

人前列腺癌DU-145细胞中肿瘤干细胞的富集及鉴定

目的从人前列腺癌DU-145细胞中富集具有干细胞特性的肿瘤细胞,并鉴定其肿瘤干细胞特性。方法利用流式细胞仪比较人前列腺癌LNCa P细胞、DU-145细胞中CD44+细胞所占比例;通过无血清连续传代培养,富集干性肿瘤细胞,计算不同时间点成球率;将无血清悬浮培养的肿瘤微球细胞,再次在含血清培养基中培养,验证肿瘤干细胞的分化特性;利用CCK-8增殖试验分别检测DU-145细胞和DU-145肿瘤微球细胞,比较两者增殖能力的差异;分别以DU-145肿瘤微球细胞、DU-145细胞为实验组和对照组制备荷瘤裸鼠模型,比较两者体内成瘤能力。结果流式细胞仪检测显示CD44+LNCa P、CD44+DU-145比例分别为0.4%、97.6%。无血清悬浮培养DU-145细胞第2日的成球率为(14.4±7.8)%,第7日的成球率为(34.2±8.7)%,第14日的成球率高达(61.4±7.6)%。悬浮成球DU-145细胞在加入含10%胎牛血清培养基24 h后,表现出和常规贴壁培养DU-145细胞相同形态。DU-145肿瘤微球细胞在铺板后24 h其增殖能力就可达到DU-145细胞的2倍左右,在第6日之后,DU-145肿瘤微球细胞存活率仍高于DU-145细胞,组间450 nm处吸光度比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。与DU-145细胞荷瘤裸鼠相比,DU-145肿瘤微球细胞荷瘤裸鼠的移植瘤体积较大、生长速度较快(P均<0.05)。结论无血清连续传代培养的DU-145细胞经富集分离可得到具有干细胞特征的前列腺肿瘤细胞,该方法简便易行,具有较理想的应用前景。

Prostate cancer and metastasis initiating stem cells

Androgen refractory prostate cancer metastasis is a major clinical challenge. Mechanism-based approaches to treating prostate cancer metastasis require an understanding of the developmental origin of the metastasis-initiating cell. Properties of prostate cancer metastases such as plasticity with respect to differentiated phenotype and androgen independence are consistent with the transformation of a prostate epithelial progenitor or stem cell leading to metastasis. This review focuses upon current evidence and concepts addressing the identification and properties of normal prostate stem or progenitor cells and their transformed counterparts.