炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的预测及耐药性与毒力分析

【目的】预测并分析炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的比例、前噬菌体携带抗生素耐药基因与毒力基因的情况,了解并分析炭疽芽孢杆菌前噬菌体对菌株耐药性与毒力的影响,为后续研究与应用炭疽芽孢杆菌前噬菌体提供借鉴。【方法】利用PHASTER在线分析软件预测炭疽芽孢杆菌携带的前噬菌体,采用抗生素耐药基因数据库(comprehensive antibiotic research database,CARD)和毒力因子数据库(virulence factors database,VFDB)预测前噬菌体携带的抗生素耐药基因和毒力因子。【结果】预测到1421条炭疽芽孢杆菌前噬菌体,其中完整型前噬菌体267条,疑似型前噬菌体321条,不完整型前噬菌体833条。每株炭疽芽孢杆菌所携带的全部前噬菌体基因组占其基因组比例为3%~4%。771条前噬菌体携带1075个耐药基因。耐药表型共有29种,分别来自28种不同的耐药家族,涵盖6种抗生素耐药的作用机制。394条前噬菌体编码688个毒力因子,归类为71种毒力基因和52种毒力因子。分析毒力因子可能的宿主菌株来源构成发现,除炭疽芽孢杆菌外,嗜肺军团菌亚种、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等也有较高的结构比例,是毒力因子可能的宿主来源。【结论】炭疽芽孢杆菌普遍携带前噬菌体,但前噬菌体基因组在炭疽芽孢杆菌基因组中所占的比例较低。约54%前噬菌体携带抗生素耐药基因,以膦酸类、β-内酰胺类抗生素等为主。约28%前噬菌体携带毒力基因。前噬菌体在炭疽芽孢杆菌抗生素耐药基因的获取与传递、毒力基因的获得与传播及致病性演变过程中可能发挥着一定作用。

猪源ST9型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中前噬菌体的流行状况与转导分析

本研究旨在分析猪源ST9型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, MRSA)中前噬菌体的流行情况、结构特点和转导能力,探究前噬菌体在猪源MRSA流行克隆形成中的作用。基于全基因组信息,分析了近年来从我国多省分离的131株ST9型MRSA中前噬菌体的流行率、分型、亲缘关系和结构特征;选取含不同分型前噬菌体的菌株进行诱导,对诱导获得的噬菌体颗粒进行转导,测定转导子的耐药表型及体外适应性。研究结果显示:猪源ST9型MRSA的前噬菌体携带率为78.6%(103/131株),其中,63株携带完整前噬菌体序列,所有前噬菌体序列均不含耐药基因,仅2.9%(3/103株)的前噬菌体序列含毒力基因;前噬菌体谱型丰富,其整合酶分型主要为Sa2int和Sa4int;各型别前噬菌体结构同源性较高,完整前噬菌体可被诱导为长尾噬菌体;噬菌体颗粒可包装供体菌的aadD、tet(L)耐药基因并转导至受体菌中;转导子可获得卡那霉素、四环素耐药表型,体外生长能力与受体菌株无明显差异(P>0.05)。研究结果表明:猪源ST9型MRSA的前噬菌体携带率较高,谱型丰富,不携带耐药基因,部分噬菌体可包装供体菌的耐药基因转导至受体菌,产生的适应性代价小。

不携带霍乱毒素基因的CTXΦ类前噬菌体基因组克隆与分析

霍乱弧菌的霍乱毒素基因ctxAB由其溶原性噬菌体CTXΦ编码 ,由此携带毒素基因在产毒株与非产毒株间水平转移。从无ctxAB的ElTor型菌株中 ,发现不同时间、地点来源的部分菌株仍带有CTXΦ基因组的其它基因 ,在研究菌株染色体上呈双拷贝串联排列。克隆后测序发现基因组全长 5 70 8bp ,其抑制基因rstR却与古典型菌株来源CTXΦ的相同 ,因此从E1Tor菌株中发现整合有古典型来源的这类噬菌体。其它各基因与CTXΦ序列基本一致 ,但nct CTXΦ的zot基因末端及下游间隔区与CTXΦ的相差很大 ,进一步的序列测定与比较表明nct CTXΦ中无ctxAB应是其固有结构 ,而不是ctxAB丢失所形成的。将这种独特的前噬菌体命名为nct CTXclassΦ。研究菌株染色体上nct CTXΦ基因组上下游也各存在TLC因子和RTX毒力基因簇的同源序列 ,揭示它们与nct CTXΦ基因组有与CTXΦ相同的联系。从序列分析上认为nct CTXΦ与CTXΦ在遗传分化上有不同 ,可能是CTXΦ的前体形式 ,这对CTXΦ的来源。

前噬菌体研究进展

噬菌体是地球上最多的生物实体,一直被认为是细菌的天敌。然而随着基因组学和分子生物学等技术的快速发展,人们发现噬菌体与宿主之间存在微妙而复杂的关系。前噬菌体是指溶原性细菌内存在的整套噬菌体DNA基因组,广泛分布在细菌基因组中,对调节细菌宿主生理具有重要作用,如参与调节宿主的毒力、影响生物膜形成、赋予宿主免疫力等。有趣的是,前噬菌体可以通过“监听”细菌的群体感应来调节自身的溶原–裂解状态。近年来,一些细菌中由前噬菌体编码的抗CRISPR蛋白的发现引起了人们对前噬菌体研究的关注。因此,对前噬菌体的研究可以为改造宿主和前噬菌体提供基础理论参考。本文对前噬菌体的预测、分布、分类及功能进行了综述,以期为进一步研究噬菌体与宿主间的关系提供基础。

前噬菌体lamdaSa04对鱼源无乳链球菌环境适应性及致病性的影响

[目的]本文旨在调查前噬菌体lamdaSa04对鱼源无乳链球菌GD201008-001环境适应性和毒力的影响。[方法]利用同源重组技术构建前噬菌体lamdaSa04基因缺失株,比较缺失株与野生株在体外生长、抗环境应激、抗巨噬细胞吞噬、胞内存活以及感染小鼠的存活率和组织细菌载量等方面的差异。[结果]lamdaSa04基因簇缺失不影响无乳链球菌GD201008-001的体外生长能力,但生物被膜形成能力下调38.57%;在10和20 mmol·L^(-1)H_(2)O_(2)的强氧化应激条件下,缺失株存活率较野生株分别下调22.86%及42.01%;小鼠巨噬细胞RAW264.7对缺失株的吞噬率比野生株上调76.12%。模拟巨噬细胞的内环境,在强氧化、一氧化氮、溶菌酶、强酸等多因素结合的应激条件下,检测菌株的存活率,结果表明lamdaSa04的存在有助于无乳链球菌在氧化应激和酸应激条件下的存活。动物试验结果显示,缺失lamdaSa04基因对小鼠致死率及组织细菌载量无明显影响。[结论]前噬菌体lamdaSa04的存在对无乳链球菌的环境适应性有显著影响,但并不影响细菌的致病性。

前噬菌体对细菌毒力的影响

前噬菌体是溶原性噬菌体整合在细菌染色体上的DNA,它们在细菌基因组中广泛存在,在病原菌中更是频繁存在,且与细菌的毒力密切相关。本文从前噬菌体增强细菌的黏附性、编码细菌毒素和调控毒素的产生与释放、协助细菌逃避宿主防御、参与细菌生物被膜的形成和降低细菌的毒力方面论述了前噬菌体对细菌毒力的影响,以增加人们对噬菌体的了解,并为研究细菌的毒力提供参考,进而为人们制定从噬菌体的角度来消除病原菌的方针和策略提供依据。

前噬菌体对猪链球菌毒力、环境适应性、耐药性及代谢活动的影响

旨在了解和掌握前噬菌体与猪链球菌(Streptococcus suis,SS)毒力、环境适应性、耐药性及代谢活动之间的关系,本研究对前噬菌体阳性菌株(简称阳性菌)与前噬菌体阴性菌株(简称阴性菌)进行了致病性试验、LD_(50)的测定、组织荷菌数的测定及病理组织学观察、生物被膜(BF)形成能力的测定、药敏试验和转录组测序。结果显示:39株阳性菌和7株阴性菌中,各有11株和2株菌对小鼠致死率≥80.0%,11株阳性菌LD_(50)为8.4×10^(8)~2.36×10^(9)CFU·只^(-1),2株阴性菌LD_(50)分别为1.88×10^(9)、2.72×10^(9)CFU·只^(-1),阳性菌与阴性菌之间LD_(50)差异不显著(P>0.05)。LD_(50)为8.4×10^(8)CFU·只^(-1)的阳性菌攻毒后小鼠各脏器(肺、肝、脾、肾、心、脑)组织荷菌数最多,病理变化最明显,LD_(50)为2.72×10^(9)CFU·只^(-1)的阴性菌攻毒后小鼠各脏器组织荷菌数最少,病理变化最轻微;BF形成阳性率阳性菌为97.4%,阴性菌为100.0%;阳性菌和阴性菌均对四环素、红霉素、克林霉素、阿奇霉素、头孢曲松、多西环素呈现多重耐药,二者的耐药性无显著差异(P>0.05);相较于阳性菌,毒力相关基因、BF形成相关基因、耐药基因、脂肪酸生物合成通路以及精氨酸和脯氨酸代谢通路中所涉及到的相关基因在阴性菌中多为上调表达。综上表明:前噬菌体存在与否与SS的毒力增强或减弱、耐药性的高或低以及BF的形成能力之间未有明显相关性;但前噬菌体的存在会引致与SS脂肪酸生物合成以及精氨酸和脯氨酸代谢过程中相关联基因的表达下调,从而造成脂肪酸和氨基酸代谢水平降低。

多重耐药大肠杆菌中前噬菌体的分布特征及诱导分离

【目的】通过调查前噬菌体在多重耐药大肠杆菌中的分布特征、诱导分离以及前噬菌体中耐药基因与毒力基因的流行状况,为研究前噬菌体介导耐药基因在细菌的传播提供科学依据。【方法】挑选前期保存的2018-2019年广东省分离的131株禽源多重耐药大肠杆菌进行核酸提取及全基因组测序,将二代测序的结果组装拼接成全基因组序列,上传至噬菌体PHASTER网络数据库与数据库中已有的噬菌体基因组序列进行比对分析。利用CGE数据库比对耐药基因与毒力基因,从而获得在前噬菌体上耐药基因与毒力基因的分布情况。温和性噬菌体由丝裂霉素C诱导并使用双层平板法分离纯化。【结果】131株大肠杆菌药物敏感性试验的结果显示,氨苄西林、四环素、氟苯尼考、复方新诺明的耐药率均高达90%以上,其次是头孢类抗生素以及庆大霉素、环丙沙星、美罗培南和黏菌素均在50%左右,替加环素的耐药率达到了0.2%,所有菌株都呈现出多重耐药的现象,均为多重耐药大肠杆菌。131株多重耐药大肠杆菌中共检出736个前噬菌体片段,其中包含329个完整型前噬菌体,其与40个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上;可疑型噬菌体有66个,其与20个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上;不完整型噬菌体有341个,其与52个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上,完整型前噬菌体的基因序列显示出与已知的噬菌体物种的序列相似性最高,平均为58.53%;131株大肠杆菌中平均前噬菌体数量为5.6个,平均总含量为152.4 kb。前噬菌体基因组占其宿主基因组的比例分布在0.58%-5.87%,以3.0%为主。前噬菌体基因组长度范围在2.8-107.9 kb,其中13.0 kb的前噬菌体出现的频次最高,占所有前噬菌体的9.1%。CGE比对结果表明,131株多重耐药大肠杆菌的基因组共在18株前噬菌体序列检测到耐药基因mdf(A)、lnu(G)和mcr-1,其中mdf(A)、lnu(G)和mcr-1检出数分别为16、1和1。71株多重耐药大肠杆菌前噬菌体中携带有6种不同的毒力基因,其中存在部分菌株携带2种或者3种毒力基因,有62株前噬菌体携带端粒酶RNA基因terC,16株前噬菌体携带血清存活率增加基因iss,外膜蛋白酶ompT、黏附素基因iha、cvaC和ABC转运蛋白基因mchF分别在2、2、1和1株前噬菌体中检出。mdf(A)和terC分别是前噬菌体中最常见的耐药基因和毒力基因。温和性噬菌体诱导试验结果显示,前噬菌体的诱导成功率为84.0%,但出现噬菌斑的概率仍比较低。【结论】前噬菌体在多重耐药大肠杆菌中分布广泛且携带有多种耐药基因和毒力基因,温和性噬菌体诱导成功率高,具有携带耐药基因及毒力基因水平传播的风险,需要加强和持续监测。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体片段CP-933Y,进而构建CP-933Y缺失突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7菌株为模板,加入酶切位点PCR扩增前噬菌体CP-933Y上、下游各600 bp的同源臂序列;酶切后分别连接到p UC19-kan质粒的卡那霉素(包含FRT位点)抗性基因两侧,构建中间是卡那霉素抗性基因标记含有目的基因上、下游同源序列的线性片段;导入含有p KD46质粒的O157∶H7菌株中,利用Red编码的同源重组酶使该片段与目的基因上、下游发生同源重组,卡那霉素抗性基因置换菌株中CP-933Y前噬菌体片段,最后导入p CP20质粒去除卡那霉素抗性标记基因。结果:经PCR及测序验证,O157∶H7菌株中前噬菌体片段CP-933Y被敲除,敲除株与野生株具有相似的生长曲线。结论:构建了大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失株,为进一步研究前噬菌体CP-933Y的功能奠定了基础。

单增李斯特菌前噬菌体的分布及遗传特征分析

目的 了解单增李斯特菌基因组中前噬菌体分布状况和基因组特征。方法 自公共数据库GenBank获得275株单增李斯特菌的全基因组序列,运用前噬菌体在线预测软件(PHASTER)对其携带的前噬菌体进行预测。并对预测的完整前噬菌体进行聚类分析、插入位点识别、噬菌体整合酶多态性分析。此外,通过比对耐药基因和毒力基因数据库,搜寻前噬菌体可能携带的耐药基因和毒力基因。结果 本研究发现99.3%的单增李斯特菌基因组含有前噬菌体序列,155株(56.4%)单增李斯特菌基因组预测到229个完整前噬菌体序列。所有完整前噬菌体聚集成4个群,进一步划分为10个簇。前噬菌体分群与其宿主菌所属家系具有较强的相关性,但与宿主菌来源无关。本研究识别到10个前噬菌体插入位点,其中lmot17(tRNAArg),lmot11(tRNASer)和comK是3个最常见的插入位点,lmo1263为新发现的插入位点。相同插入位点前噬菌体所携带整合酶氨基酸序列高度相似。此外,研究发现部分家系Ⅲ菌株和1株家系Ⅰ菌株的噬菌体中携带毒力相关蛋白E编码基因(virE),所有完整前噬菌体中未发现耐药基因。结论 单增李斯特菌普遍携带前噬菌体,超过半数的菌株携带完整前噬菌体,其基因组具有多样性,且在宿主菌染色体中具有多个插入位点。这些插入位点与噬菌体所携带整合酶氨基酸序列密切相关。此外,未发现前噬菌体中携带耐药基因。

前噬菌体

随着微生物基因组测序工作的广泛展开,前噬菌体在宿主菌基因组中普遍存在的事实已逐渐为人们所接受。相关研究工作的深入揭示前噬菌体并不只是细菌体内一个简单的寄生体,相反是细菌生理活动相当活跃的参与者,在宿主菌生命活动中发挥着重要的作用。对前噬菌体的深入了解将丰富人们对多种生命现象的认识。本文即是关于前噬菌体的分类、分布、鉴定、进化及其与宿主菌相互作用等知识点的一个简单综述。

小肠结肠炎耶尔森菌基因组中前噬菌体基因结构特征分析

目的了解小肠结肠炎耶尔森菌基因组中前噬菌体和噬菌体元件的携带情况及基因组结构特征。方法利用PHAST软件,对NCBI数据中18株已完成全基因组测序完成图的小肠结肠炎耶尔森菌的前噬菌体区域进行预测,并与参考噬菌体基因组序列进行比对,分析小肠结肠炎耶尔森菌前噬菌体基因的分布及其基因组特征。结果 18株小肠结肠炎耶尔森菌全基因组序列中前噬菌体携带率100%,共预测到141个前噬菌体区域,其中71个是具有完整噬菌体特征的前噬菌体,其余70个属于噬菌体元件。非致病性小肠结肠炎耶尔森菌LC20预测到的噬菌体区域最多,含有9个完整的前噬菌体和7个噬菌体元件,在一定程度上解释LC20菌株染色体基因组大于其余菌株,且含有更多重组及SNP位点的原因。截取71个完整前噬菌体区域的序列信息,与112株NCBI公布的噬菌体基因组序列进行聚类分析显示,共分为两个大簇。预测的前噬菌体与已知噬菌体之间不存在共有的核心基因组。部分前噬菌体区域含有毒力相关基因。结论小肠结肠炎耶尔森菌基因组中的前噬菌体具有基因组多样性,为噬菌体和宿主菌的协同进化研究奠定基础。

福氏痢疾杆菌2b血清型菌株基因组中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式研究

目的 研究福氏痢疾杆菌2b血清型菌株中SfII和SfX前噬菌体整合位点及排列方式.方法 根据2b血清型菌株基因组中SFII和SfX前噬菌体可能的整合位点及排列方式,设计引物,对50株2b血清型菌株进行PCR扩增,并对扩增产物测序,根据扩增和测序结果判断噬菌体的整合位点和排列方式.结果 在2b血清型菌株中,SfII和SfX前噬菌体前后相连,整合于宿主菌染色体proA和yaiC基因间的thrW tRNA基因上;以SfII在前,SfX在后,或SfX在前,SfII在后两种方式排列;而以后一种方式为主,在共50株检测菌株中,有49株为此方式.结论 福氏痢疾杆菌血清型相关噬菌体的整合位点及排列方式,对研究福氏痢疾杆菌血清型转换及血清型相关噬菌体的整合机制具有重要意义.

高效广谱猪链球菌7型前噬菌体裂解酶的挖掘及活性研究

【目的】噬菌体具有防控耐药性病原菌的抗菌应用潜力,但是有些病原菌噬菌体的获得非常困难,研究发现大多数病原菌存在前噬菌体(Prophage),且由前噬菌体编码的裂解酶(Endolysin)具有良好的抗菌应用前景,本研究将挖掘猪链球菌前噬菌体及其编码的裂解酶。【方法】通过对Gen Bank中登录的数株猪链球菌前噬菌体裂解酶的基因信息分析,挖掘出一株猪链球菌7型菌株前噬菌体编码的裂解酶,研究其生物学活性。以猪链球菌7型菌株7917的基因组为模板,采用PCR技术扩增获得裂解酶基因ly7917,将其克隆至质粒p ET28a(+)并转化大肠杆菌DH5α细胞,挑选基因序列正确的阳性克隆、抽提质粒、转化表达菌株大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可高效表达裂解酶Ly7917。【结果】平板裂解试验结果显示Ly7917具有高效裂菌活性,能够裂解猪链球菌2型高致病力菌株HA9801;浊度递减试验结果显示该裂解酶能够高效裂解猪链球菌2型、7型、9型和马链球菌兽疫亚种参考株、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)等多种革兰氏阳性菌。【结论】基于前噬菌体挖掘的裂解酶Ly7917,具有高效广谱裂菌活性,为临床上利用裂解酶治疗耐药菌的混合感染提供了可能。

猪链球菌2型前噬菌体基因的检测及其与毒力基因分布的关系

为了探究猪链球菌(Streptococcus suis,SS)2型菌株中前噬菌体基因与毒力因子分布的关系,利用生物信息学方法预测了19株已全基因测序的SS2中的前噬菌体基因分布,并设计前噬菌体保守基因引物2对,通过PCR检测前噬菌体在101株SS2菌株中的分布,并与毒力因子分布进行比较。结果表明,已全基因测序的猪链球菌2型菌株中,弱毒株含有比强毒株更多的前噬菌体片段。PCR检测显示,14株4种代表性毒力因子(sbp2',mrp,ef,sly)为阴性的菌株中均含有前噬菌体解旋酶基因和末端酶基因,而86株不完全含有这4种代表性毒力因子的菌株中不含有上述前噬菌体基因,说明猪链球菌2型菌株中毒力因子分布与前噬菌体基因分布无明显相关性。

前噬菌体对禽致病性大肠杆菌DE205B环境耐受力的影响

禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)DE205B基因组中存在前噬菌体phiv205-1。本文利用RED同源重组技术构建前噬菌体phiv205-1缺失株,采用倍比稀释的方法检测野生株DE205B和前噬菌体缺失株DE205BΔphiv205-1在酸、盐和氧化应激等不利条件下的存活率,分析前噬菌体对APEC环境适应力的影响。结果显示,与野生株相比,前噬菌体缺失株DE205BΔphiv205-1酸性耐受力下降了56.62%(P<0.001),在氧化应激条件下的存活率下降了91.78%(P<0.001)。为研究前噬菌体phiv205-1中影响宿主细菌对酸和氧化应激耐受的基因,采用real-time PCR检测了部分phiv205-1基因在氧化应激环境中的表达量,结果显示基因2971、2989、3327及Erf的表达量显著升高。进一步构建了Δ2971、Δ2989、Δ3327及ΔErf的单基因缺失株,环境耐受实验结果显示,与野生株相比,单基因缺失株Δ2971、Δ2989、Δ3327及ΔErf在H2O2环境下的存活率依次降低了89.32%、67.79%、27.84%和71.29%。研究表明,前噬菌体phiv205-1增加了细菌对环境压力的抵抗力,为宿主菌在恶劣条件下的生存提供了多种益处。

鲍曼不动杆菌携带前噬菌体的生物信息学分析

【目的】预测并分析82株全基因组测序的鲍曼不动杆菌前噬菌体的携带情况,鉴定前噬菌体编码的抗生素耐药基因和毒力因子。【方法】利用PHASTER(Phage Search Tool Enhanced Release)软件预测鲍曼不动杆菌携带的前噬菌体,采用CARD(The Comprehensive Antibiotic Research Database)和VFDB(Virulence Factors Database)在线分析软件预测前噬菌体编码的抗生素耐药基因和毒力因子。【结果】预测到472条鲍曼不动杆菌前噬菌体,其中完整型前噬菌体201条,疑似型前噬菌体91条,缺陷型前噬菌体180条。平均每株鲍曼不动杆菌基因组中可携带至少2条完整型前噬菌体。每株鲍曼不动杆菌所携带的全部前噬菌体占其基因组比例约为4%–6%。29条前噬菌体携带77个耐药基因,耐药表型共有14种,分别来自15个不同的家族,涵盖6种抗生素耐药的作用机制。132条前噬菌体编码毒力基因,归类为38种毒力基因和34种毒力因子。不同类型的前噬菌体普遍携带1–2种毒力因子,少数前噬菌体携带3种及以上毒力因子。分析毒力因子可能的宿主来源构成比发现,除鲍曼不动杆菌外,脑膜炎奈瑟菌、痢疾志贺氏菌、嗜肺军团菌及其亚种等也有较高的结构比例,是可能的宿主来源。【结论】鲍曼不动杆菌普遍携带前噬菌体,但前噬菌体基因在鲍曼不动杆菌基因组中所占比例不高。部分前噬菌体携带抗生素耐药基因,以氨基糖苷类、磺胺类及β-内酰胺类耐药为主。约30%的前噬菌体携带毒力基因。前噬菌体可能在鲍曼不动杆菌抗生素耐药性的获得、传播及致病性演变中发挥重要作用。

食源性希拉肠球菌R17基因组中前噬菌体的结构特征及其与宿主菌的相互影响

目的了解生鲜猪肉中分离的希拉肠球菌R17基因组中前噬菌体的结构特征及其和宿主菌的相互影响。方法利用PHAST软件预测希拉肠球菌R17基因组中前噬菌体基因的分布及其编码基因特征,分析前噬菌体中含有的毒力基因、耐药基因和环境抗性基因。结果在希拉肠球菌R17染色体上有3个前噬菌体,其中Prophage-1和Prophage-2是不完整的前噬菌体,Prophage-3是完整的前噬菌体。染色体上的噬菌体携带了多个细菌功能编码基因,包括与核苷酸转运和代谢功能相关的基因。希拉肠球菌R17质粒上有一个不完整的、携带了红霉素和杆菌肽耐药基因的前噬菌体Prophage-p,推测前噬菌体介导的基因水平转移使希拉肠球菌R17对红霉素和杆菌肽产生了耐药性。结论希拉肠球菌基因组中的前噬菌体具有多样性。前噬菌体在肠球菌向耐药菌进化过程中发挥了重要作用,应重视监控噬菌体介导的耐药性和致病性在食品中的扩散。

金黄色葡萄球菌前噬菌体PT1028ORF001基因的生物信息学分析及原核表达

[目的]对金黄色葡萄球菌前噬菌体的PT1028ORF001基因进行生物信息学分析,并进行原核表达,为金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能研究提供参考数据。[方法]将金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株功能未知的基因通过BLAST比对,从中发现了一个噬菌体PT1028的基因序列,将该基因命名为PT1028ORF001。使用Protparam、Prot Comp9. 0、NCBI保守结构域数据库、TMpred、Net Phos 3. 1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等在线生物信息软件,分析PT1028ORF001蛋白的理化性质、亚细胞定位、保守结构域、跨膜区域、磷酸化修饰位点、二级结构和三维结构。用自行设计的引物扩增PT1028ORF001基因,扩增产物经酶切回收后与原核表达载体p ET-32a相连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转化E. coli TG1内,经菌落PCR鉴定后,增菌培养并提取质粒,再转化E. coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测分析。[结果]PT1028ORF001蛋白由569个氨基酸组成,相对分子质量为64 671. 34 Da,等电点为8. 07,负电荷氨基酸残基总数为71个,正电荷氨基酸总数为73个,分子式:C2894H4530N762O885S16,原子总数9087个,是一种稳定的亲水蛋白质,定位于细胞膜上,与功能未知的DUF927蛋白超家族具有高度同源性,第202-223、240-258位氨基酸分别形成一个典型的跨膜区,潜在的磷酸化修饰位点共71个,二级结构中ɑ螺旋占比最高(40. 60%),其次是无规则卷曲(39. 89%),三维空间结构与二级结构预测结果相符。成功构建了表达载体p ET-32a(+)-PT1028ORF001,经IPTG诱导后重组蛋白获得了表达,蛋白相对分子质量为82. 4 k Da。[结论]PT1028ORF001基因的生物信息学分析结果以及该基因的成功克隆与表达,为深入研究该蛋白及其他金黄色葡萄球菌前噬菌体基因的功能奠定了一定基础。

产气荚膜梭菌前噬菌体的分布特点及遗传进化分析

【目的】分析和研究产气荚膜梭菌中前噬菌体的分布情况、基因组特点及遗传进化关系。【方法】利用PHASTER(phage search tool enhanced release)软件预测产气荚膜梭菌携带的前噬菌体,基于ANI(average nucleotide identity)值对前噬菌体进行分群,利用CARD(comprehensive antibiotic research database)、Res Finder 4.1、VFDB(virulence factors database)和Bac Met(antibacterial biocide&metal resistance genes database)分析前噬菌体携带的耐药基因、毒力基因、抗菌剂/金属离子抗性基因,利用CRISPRCas Finder分析产气荚膜梭菌的CRISPR-Cas系统,利用MEGA 7.0进行前噬菌体的遗传进化关系分析。【结果】产气荚膜梭菌平均携带前噬菌体2.67条,其长度呈双峰分布,平均占基因组2.23%;前噬菌体不携带耐药基因,但携带了α毒素、唾液酶和溶血素等毒力基因以及重金属代谢基因;前噬菌体聚为3个类群,Group 1前噬菌体多为完整的前噬菌体且仅存在于A型产气荚膜梭菌;含完整的CRISPR-Cas系统的产气荚膜梭菌携带的前噬菌体相对较少,但CRISPR-Cas系统与前噬菌体的数量呈弱负相关;前噬菌体与产气荚膜梭菌噬菌体的遗传进化距离较远,仅有结构蛋白和部分酶类基因的同源性较高。【结论】产气荚膜梭菌普遍携带前噬菌体,但其CRISPR-Cas系统对前噬菌体的数量影响较小,前噬菌体携带的毒力基因和重金属代谢基因增强了产气荚膜梭菌致病性和对环境的适应性,但其功能和对产气荚膜梭菌遗传进化的影响仍需深入研究。