miR-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用及机制探讨

目的:研究微小RNA(miR)-497-5p在前成骨细胞MC3T3-E1分化和矿化中的作用,并探讨其相关机制。方法:取第3代MC3T3-E1细胞,分别转染miR-497-5p过表达质粒miR-497-5p mimics、低表达质粒miR-497-5p inhibitor和阴性对照质粒miR-497-5p NC,设为miR-497-5p mimics组、miR-497-5p inhibitor组和miR-497-5p NC组。取不做处理的细胞作为空白组。成骨诱导后14天,检测碱性磷酸酶(ALP)活性;免疫印迹法检测成骨分化相关蛋白骨钙素(OCN)、I型胶原(COL-I)蛋白表达量;茜素红染色法观察矿化情况;免疫印迹法检测Smad泛素化调节因子2(Smurf2)蛋白表达量;双荧光素酶实验验证miR-497-5p与Smurf2的靶向关系。采用SPSS 25.0软件包进行统计学分析。结果:与空白组、miR-497-5p NC组相比,miR-497-5p mimics组ALP活性显著增强,OCN、COL-I蛋白表达量及矿化结节面积构成比显著升高,Smurf2蛋白表达量显著降低(P<0.05);miR-497-5p inhibitor组ALP活性显著减弱,OCN、COL-I蛋白表达量及矿化结节面积构成比显著降低,Smurf2蛋白表达量显著升高(P<0.05);与Smurf2 3’-UTR-WT+miR-497-5p NC组、Smurf2 3’-UTR-MT+miR-497-5p mimics组和Smurf2 3’-UTR-MT+miR-497-5p NC组相比,Smurf2 3’-UTR-WT+miR-497-5p mimics组双荧光素酶活性值显著降低(P<0.05)。结论:过表达miR-497-5p对前成骨细胞MC3T3-E1的分化和矿化具有促进作用,其作用机制可能与负性靶向调控Smurf2蛋白表达有关。

TiO_2纳米管对MC3T3-E1前成骨细胞骨功能基因表达变化的影响

目的:研究阳极氧化TiO2纳米管对MC3T3-E1前成骨细胞骨功能基因表达变化的影响。方法:采用阳极氧化法在钛基底表面制备TiO2纳米管,扫描电镜观察其表面微结构,肌动蛋白染色研究细胞在材料表面的粘附生长情况,Real-time PCR技术系统分析材料对细胞骨功能基因表达的影响规律。结果:MC3T3-E1前成骨细胞在TiO2纳米管表面比光滑钛有更大的伸展面积,培养1周后,TiO2纳米管提高了细胞骨功能基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙蛋白的表达水平(P<0.05),培养2周后,骨功能基因表达水平与对照组之间没统计学差异。结论:TiO2纳米管可以促进MC3T3-E1前成骨细胞肌动蛋白组装,同时可以提高细胞骨功能基因的早期表达水平。

mTORC1信号促进前成骨细胞MC3T3-E1的分化成熟

目的:研究mTORC1信号对前成骨细胞MC3T3-E1向成骨细胞分化成熟的调控作用。方法:通过向MC3T3-E1转染pcDNA3.1-Raptor,对mTORC1信号相关蛋白Raptor进行过表达。向MC3T3-E1转染Raptor siRNA,对mTORC1信号蛋白Raptor进行基因沉默。通过Real-time PCR方法测定Raptor的基因表达,通过蛋白免疫印迹法测定Raptor蛋白水平,并通过茜素红染色检测成骨矿化情况,以测定成骨分化程度。通过Real-time PCR检测成骨分化指标的基因表达。结果:与对照组相比,Raptor过表达组的Raptor mRNA和蛋白水平明显增加;茜素红染色结果显示Raptor过表达组染色更深,说明成骨矿化程度更高;荧光定量PCR结果显示,Raptor过表达组的成骨分化标记基因以及成骨转录因子的表达量均高于对照组。与对照组相比,Raptor siRNA组的Raptor mRNA和蛋白水平明显降低;茜素红染色结果显示Raptor siRNA组染色更浅,说明成骨矿化程度更低;荧光定量PCR结果显示,Raptor siRNA组的成骨分化标记基因以及成骨转录因子的表达量均低于对照组。结论:mTORC1信号促进前成骨细胞MC3T3-E1向成骨细胞分化成熟。

补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞增殖活性及细胞周期影响的实验研究

目的:观察补肾活血固齿方对小鼠颅顶前成骨细胞(MC3T3-E1细胞)增殖活性及细胞周期变化的影响,探讨该方剂治疗牙周炎的作用机理。方法:MC3T3-E1细胞分别于5%、10%、15%、20%补肾活血固齿方含药血清,10%无药血清,10%胎牛血清中培养12、24、36、48、60、72 h,MTT法检测补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响。另外MC3T3-E1细胞分别于10%补肾活血固齿方含药血清、无药血清、胎牛血清中培养24、48、72 h,用流式细胞仪检测该方剂对MC3T3-E1细胞细胞周期的影响。结果:含药血清与胎牛血清、无药血清组相比,MC3T3-E1细胞增殖活性及细胞周期差异无显著性(P>0.05)。结论:补肾活血固齿方对MC3T3-E1细胞增殖活性及细胞周期无影响,其可能是通过促进该细胞向成骨细胞分化、促进牙槽骨的再生而发挥药物作用。

罗格列酮联合甘精胰岛素对前成骨细胞的影响

将小鼠MC3T3-E1成骨样细胞传代培养后分为8组：正常对照组（NC）;成骨诱导对照组（OI）;罗格列酮5μmol/L组（R5）;罗格列酮10μmol/L组（R10）;甘精胰岛素10-7mol/L组（G10-7）;甘精胰岛素10-8mol/L组（G10-8）;罗格列酮5μmol/L＋甘精胰岛素10-8mol/L组（R5＋G10-8）及罗格列酮10μmol/L＋甘精胰岛素10-7mol/L组（R10＋G10-7）。分别测定MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性及增殖能力。结果与正常对照组比较,R10组能抑制前成骨细胞的增殖。而R10＋Q108组与R10组相比,能对抗罗格列酮的抑制细胞增殖的作用,使细胞数目增加,P〈0.05。与正常对照组比较,OI组能刺激前成骨细胞分泌碱性磷酸酶,与正常对照组相比,2个浓度的罗格列酮与甘精胰岛素均减少了ALP的活性。而且罗格列酮组ALP活性的下降比甘精胰岛素组明显。高浓度联合用药组ALP活性也明显低于对照组,但是联合用药组ALP活性值比罗格列酮单药组高,R5＋G10-8组ALP活性值和R5组相比,（P〈0.05）。结论：罗格列酮能抑制前成骨细胞增殖,甘精胰岛素能对抗罗格列酮抑制细胞增殖的作用;罗格列酮与甘精胰岛素均可抑制前成骨细胞分化,甘精胰岛素与罗格列酮联用,能对抗罗格列酮抑制前成骨细胞分化的作用。

骨形态发生蛋白2/Osterix信号通路调控的前成骨细胞分化

背景:研究发现Osterix基因的表达能够受到骨形态发生蛋白2信号通路的调控,从而调节骨的形成发育。目的:分析骨形态发生蛋白2/Osterix信号通路对小鼠前成骨细胞分化的调控作用。方法:将骨形态发生蛋白2作用于前成骨细胞,利用实时定量RT-PCR法及免疫印迹法检测不同时间段Osterix m RNA和蛋白的表达水平;构建pc DNA3.1/myc-Osterix真核表达载体,并转染至前成骨细胞,利用实时定量RT-PCR法检测转染Osterix真核表达载体和骨形态发生蛋白2作用后碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白(MEPE)的m RNA表达水平。结果与结论:(1)实时定量RT-PCR法检测结果表明骨形态发生蛋白2上调Osterix m RNA在小鼠前成骨细胞中的表达水平,并在24 h时上调作用最为显著;(2)免疫印迹法检测骨形态发生蛋白2显著上调Osterix蛋白的表达水平;(3)成功构建了pc DNA3.1/myc-Osterix真核表达载体,在转染小鼠前成骨细胞和以骨形态发生蛋白2作用后检测到碱性磷酸酶、骨涎蛋白、细胞外基质磷酸化糖蛋白的m RNA表达显著增强;(4)结果说明,骨形态发生蛋白2通过上调小鼠前成骨细胞中Osterix的表达来调控碱性磷酸酶、细胞外基质磷酸化糖蛋白等成骨标志基因的合成,表明骨形态发生蛋白2/Osterix这一信号通路在骨发育过程中具有重要作用。

青藤碱对前成骨细胞增殖、分化的影响及可能的作用机制

目的观察青藤碱对前成骨细胞增殖分化的影响并探讨可能的作用机制。方法将不同浓度的青藤碱作用于前成骨细胞并诱导后,运用MTT检测细胞活性,ALP法测定碱性磷酸酶的含量,从基因及蛋白水平检测OPG,RANKL表达。结果青藤碱对细胞增殖率无明显影响,在一定程度上可以促进成骨细胞的分化及钙化,并能上调OPG的表达,同时下调RANKL的表达。结论盐酸青藤碱具有促进骨形成功能,并可以通过OPG/RANK/RANKL信号通路促进成骨细胞的分化成熟。

新型纳米材料及与前成骨细胞联合培养的实验研究

自组装的纳米纤维肽作为一种新型材料，被广泛应用于细胞的三维培养以及组织缺损的修复。本研究在传统自组装多肽RADA16—1（RAD16）的基础上，为成骨细胞体外培养构建了一种支架材料，即把细胞黏附基序arginine—glycine—aspartic（RGD）连接到RAD16上，再与纯RAD16按比例混合，构成本实验的研究材料Hybrid。用原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）观察材料的微观结构。通过相差显微镜、MTT、组织化学染色等工具或方法观察成骨细胞（MC3T3-E1）在材料中的生长、增殖和分化情况。结果显示，Hybrid可以形成良好的纳米纤维结构。与RAD16相比，这种改进的纳米材料可以促进细胞的增殖，且碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表达呈强阳性，有明显的钙结节形成。实验表明该材料在骨组织工程方面有潜在的应用价值。

磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于前成骨细胞的生物相容性

背景:将磁性纳米颗粒作为骨组织工程领域新兴材料并植入生物体时,其毒性机制基础研究及安全性评价就显得格外重要。目的:探索磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于前成骨细胞的生物相容性。方法:将含有0,200,400,800 mg/L磁性四氧化三铁纳米颗粒的细胞培养液作用于小鼠前成骨细胞24 h后,采用碱性磷酸酶活性测试试剂盒、骨钙素酶联免疫试剂盒、CCK-8试剂盒、倒置显微镜、细胞骨架荧光染色法及实时荧光定量PCR,观察处理后小鼠前成骨细胞的碱性磷酸酶活性/总蛋白比值、骨钙素浓度、细胞增殖率、细胞形态和骨架改变、细胞凋亡以及自噬相关半胱氨酸蛋白酶3、LC3A、LC3B基因m RNA表达情况。结果与结论:(1)磁性四氧化三铁纳米颗粒作用小鼠前成骨细胞24 h后,200 mg/L组与对照组(0 mg/L)相比,各项指标差异无显著性意义;(2)作用24 h后,400,800 mg/L组细胞内碱性磷酸酶活性/总蛋白比值、骨钙素浓度上升,细胞增殖率明显下降,细胞形态及骨架结构改变明显,LC3B基因转录水平升高,而半胱氨酸蛋白酶3、LC3A基因转录水平与对照组相比差异无显著性意义;(3)结果提示,高质量浓度的磁性四氧化三铁纳米颗粒作用于小鼠前成骨细胞24 h后,虽具有一定的促成骨作用,但同时可造成细胞毒性损伤,促进细胞自噬相关基因LC3B表达上调,影响细胞形态、骨架结构及细胞增殖率。

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹(Western blotting)检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶(ALP)染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物(miR-103-3p mimics)及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因m RNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制(P<0.05),Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。

Rap1b对鼠前成骨细胞Mc3T3-E1成骨分化早期的影响

目的探讨Rap1b对鼠前成骨细胞Mc3T3-E1成骨分化早期的影响。方法利用成骨诱导液诱导Mc3T3-E1成骨向分化,利用实时定量PCR分别检测诱导后0、3、7 d的Rap1b mRNA的相对表达量。同时向实验组细胞分别转染Rap1b-mus-462和Rap1b-mus-703,4 d后进行ALP染色,同时测定Rap1b的mRNA相对表达量,并对转染后细胞中成骨指标ALP、Runx2和Osterix 0、3、7 d时的mRNA相对表达量进行测定。再利用划痕实验观察siRNA转染对Mc3T3-E1细胞迁移能力的影响。结果 Real-time PCR结果显示在成骨诱导早期的不同时间点,Rap1b的表达量随诱导时间的增加而增加。当Rap1b的表达降低时,各成骨指标ALP、Runx2和Osterix的表达量也随之降低,Mc3T3-E1细胞迁移能力也有所减弱。结论 Rap1b对Mc3T3-E1细胞成骨分化早期以及细胞迁移有一定的促进作用。

基于MAPK信号通路的丹参注射液体外调控小鼠前成骨细胞的增殖分化作用

目的:探究丹参注射液对小鼠前成骨细胞的增殖分化的影响及其与有丝分裂原活性蛋白激酶(MAPK)信号通路的关系。方法:将小鼠前成骨细胞分为4组,分别采用丹参稀释液浓度为0(对照组),75,150,300 mg·L-1进行干预。采用细胞计数(CCK-8)试剂盒检测细胞光密度(OD)值;采用0.1%的茜素红溶液对细胞进行染色,并观察各组钙结节生成情况;采用实时荧光定量PCR法检测γ-羟基谷氨酸骨蛋白(BGP)及Runt相关基因2(Run×2) mRNA表达情况;采用蛋白免疫印迹法检测细胞外信号调节激酶2(ERK2)及其磷酸化状态(p-ERK1/2)、p-p38蛋白表达情况。采用抑制剂PD98059抑制ERK1/2通路,采用实时荧光定量PCR检测BGP及Run×2 mRNA表达。结果:各浓度丹参注射液组的OD值均高于对照组,其中300 mg·L-1丹参组各个孵育时间差异均有统计学意义(P<0.01)。各浓度丹参组钙结节数量均显著高于对照组,且呈浓度依赖性(P<0.05)。7 d后各浓度丹参注射液组的BGP及Run×2 mRNA表达显著高于对照组(P<0.01),且呈剂量依赖性(P<0.05)。经PD98059抑制后,300 mg·L-1丹参注射液(SM)+PD组BGP及Run×2 mRNA表达显著低于SM组(P<0.05或P<0.01)。300mg·L-1丹参组p-ERK1/2蛋白表达量和相对蛋白密度显著高于对照组(P<0.01);300 mg·L-1丹参组p-p38蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:丹参注射液对成骨细胞增殖、分化及矿化具有促进作用,其作用机制可能与激活MAPK通路中的ERK1/2细胞信号相关。

多巴胺毒性代谢产物对前成骨细胞的增殖、分化、矿化及凋亡的影响

目的:探究多巴胺的毒性代谢产物3,4-二羟基苯乙醛(DOPAL)对前成骨细胞增殖、分化、矿化及凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:培养MC3T3-E1前成骨细胞,将细胞分为对照组及不同浓度的DOPAL加药组,采用CCK-8检测DOPAL对前成骨细胞增殖的影响;qRT-PCR检测成骨细胞标志因子mRNA相对表达;茜素红染色检测其对成骨细胞骨矿化结节的影响;Tunel及Western Blot检测DOPAL对前成骨细胞凋亡的影响;Western Blot检测α-突触核蛋白(α-S)蛋白相对表达。结果:当DOPAL的加药浓度≥0.1μmol·L^(-1)时,对MC3T3-E1前成骨细胞增殖有显著的抑制作用,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,DOPAL各浓度组的成骨细胞标志因子mRNA相对表达显著下调(P<0.05或P<0.01),细胞凋亡标志因子cleaved-caspase-3蛋白相对表达、细胞凋亡率、α-S蛋白相对表达显著升高(P<0.01);DOPAL 0.1μmol·L^(-1)和0.5μmol·L^(-1)两个浓度组以上各指标差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。未加入骨诱导剂的对照组,并未出现矿化结节;与骨诱导组相比,DOPAL 0.1μmol·L^(-1)和0.5μmol·L^(-1)组抑制MC3T3-E1细胞分化成熟。结论:DOPAL抑制前成骨细胞的增殖、分化及矿化作用,且促进前成骨细胞的凋亡,可能与前成骨细胞中α-S蛋白相对表达增加从而聚集形成有神经毒性的寡聚体有关,该实验为在体研究奠定基础。

ALK2对小鼠前成骨细胞增殖和分化的影响

目的:研究激活素受体样激酶2(ALK2)对小鼠前成骨细胞增殖和分化的影响。方法:体外培养小鼠颅骨前成骨细胞,利用siRNA方法沉默Alk2基因,流式细胞术检测转染效率,实时定量RT-PCR方法检测沉默效率和成骨标志基因的表达,MTT法检测细胞增殖,茜素红染色检测矿化程度。结果:正常小鼠颅骨前成骨细胞形态不规则,多呈三角形和多角形,有较多突起;流式细胞术和实时定量RT-PCR显示siRNA可以使小鼠前成骨细胞内Alk2的表达降低至13%;MTT显示Alk2沉默后细胞数量增加;实时定量RT-PCR结果表明Alk2沉默后Runt相关转录因子2基因(Runx2)表达明显下降(P<0.05),碱性磷酸酶基因(Alp)表达有下降趋势;茜素红染色结果表明Alk2沉默后细胞矿化能力明显减弱。结论:ALK2可以抑制小鼠前成骨细胞的增殖,而促进其向成骨细胞的分化。

镁离子联合矿化胶原干预小鼠前成骨细胞的成骨分化

背景:课题组前期研究证实,镁基金属与矿化胶原联合应用在修复极限缺损时具有良好的支撑效果,可在一定程度上改善矿化胶原机械强度过差及在骨愈合期间过早塌陷的问题。然而,镁基金属在含氯化物溶液(包括人体体液或血浆)中降解较快,其中释放镁离子对成骨细胞增殖分化等的影响尚不清楚。目的:分析镁离子联合矿化胶原对小鼠前成骨细胞体外成骨分化能力的影响。方法:分别采用镁离子浓度为0,5,10,20 mmol/L的完全培养基制备矿化胶原浸提液,以4种矿化胶原浸提液培养小鼠前成骨细胞,分别设为矿化胶原组及5,10,20 mmol/L Mg2++矿化胶原组,以完全培养基培养的小鼠前成骨细胞为空白对照组。观察细胞的形态、增殖、凋亡、细胞内微丝肌动蛋白与成骨诱导分化后的碱性磷酸酶活性及成骨基因Runx2的表达。结果与结论:①培养24 h,矿化胶原组、5,10 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞贴壁情况良好,与空白对照组无明显差异,细胞形态呈长梭形,表面有多个突触与邻近的细胞相联系;20 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞呈现明显的核浓缩;②培养1,3,5 d时,10 mmol/L Mg2++矿化胶原组细胞活力高于其余4组(P<0.05),矿化胶原组、5 mmol/L Mg2++矿化胶原组与空白对照组无差异(P>0.05),20 mmol/L Mg2++矿化胶原组低于空白对照组(P<0.05);③培养3 d后DAPI染色显示,20 mmol/L Mg2++矿化胶原组可见明显细胞核解体的现象,其余4组未见明显细胞核解体;④培养24 h后鬼笔环肽染色显示,除空白对照组、20 mmol/L Mg2++矿化胶原组外,其余3组细胞结构完整伸展,肌动蛋白微丝清晰明显,尤以10mmol/LMg2++矿化胶原组最为明显;⑤成骨诱导分化7 d后,除20 mmol/L Mg2++矿化胶原组外,其余3组碱性磷酸酶活性与Runx2基因表达均高于空白对照组(P<0.05),且10 mmol/L Mg2++矿化胶原组高于5 mmol/L Mg2++矿化胶原组、矿化胶原组(P<0.05);⑥结果表明,镁离子与矿化胶原联合应用需要在适当的镁离子浓度范围(≤10 mmol/L)下进行。

聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料与小鼠前成骨细胞的成骨分化

背景:课题组前期通过冷冻干燥方法制备的矿化胶原/Mg-Ca合金复合体结构松散,使用聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥作为外层加强层对其进行改良可增强复合材料的结构稳定性。目的:探讨聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法:分别制备聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料。将MC3T3-E1细胞分别接种于聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金(A组)、聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原复合材料(B组)及Mg-Ca合金材料(C组)上,以单独培养的细胞为空白对照(D组),扫描电镜下观察材料表面的细胞黏附形态,通过CCK-8、碱性磷酸酶活性、酶联免疫吸附实验、RT-PCR与Western blot检测分析3种材料对MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的影响。结果与结论:(1)扫描电镜下可见,MC3T3-E1细胞在A组复合材料表面黏附数量最多,生长状态良好,细胞拉伸明显,伪足伸出较多,细胞相互连接成网状结构;(2)CCK-8实验显示,与D组相比,3种材料均可促进MC3T3-E1细胞的增殖(P<0.05),其中以A组复合材料促增殖效果最显著(P<0.05);(3)与D组相比,3种材料均可提升MC3T3-E1细胞中的碱性磷酸酶活性(P<0.05),其中以A组提升最显著(P<0.05);(4)酶联免疫吸附实验显示,3种材料均可促进MC3T3-E1细胞分泌骨钙素与I型胶原,其中以A组促进作用最显著(P<0.05);(5)RT-PCR检测显示,3种材料均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的m RNA表达,其中以A组提高最显著(P<0.05);(6)Western blot检测显示,3种材料均可提高MC3T3-E1细胞内RUNX2、OSX、碱性磷酸酶、骨钙素的蛋白表达,其中以A组提高最显著(P<0.05);(7)结果表明,聚甲基丙烯酸甲酯/矿化胶原/Mg-Ca合金复合材料可促进MC3T3-E1细胞成骨分化相关蛋白与基因的表达,对其成骨分化起积极作用。

神经纤毛蛋白-1在前成骨细胞成骨分化过程中及小鼠胫骨组织中的表达研究

目的探究神经纤毛蛋白-1(neuropilin 1,NRP1)在前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化过程中的m RNA和蛋白表达特征,以及其在小鼠胫骨组织中的表达情况,为临床应用信号素3A/NRP1信号轴治疗慢性根尖周炎区骨吸收提供实验基础。方法研究于2023年4—6月在中国医科大学附属口腔医院中心实验室进行。成骨分化诱导培养MC3T3-E1,并根据成骨分化时间分组。采用Western blot检测对照组(0 d)和分化1、3、5、7、10、14、20 d组的NRP1蛋白表达情况;采用qRT-PCR检测对照组和分化1、3、5、7、10、14 d组的NRP1 mRNA表达情况;对照组和成骨分化3、5 d组细胞进行免疫荧光染色,采用激光共聚焦显微镜观察成骨分化前期NRP1亚细胞定位。将3只4日龄小鼠共6根胫骨均分为NRP1组和阴性对照IgG组,并进行免疫荧光染色,采用倒置荧光显微镜观察NRP1在小鼠胫骨组织中的表达情况。结果各组NRP1蛋白及mRNA的相对表达量比较,差异均有统计学意义(F值分别为48600.000、60.030,均P<0.001);且分化7、10 d组的NRP1蛋白相对表达量较其他时间组高,分化10 d组的NRP1 mRNA相对表达量最高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在Western blot检测中NRP1主条带下方观察到分泌型NRP1(soluble NRP1,sNRP1)副条带。对照组和分化3、5 d组中,NRP1均在细胞质中表达,其亚细胞定位表现为围绕细胞核周围。NRP1在小鼠胫骨干骺端表达,且成骨区成骨细胞内表达广泛。结论NRP1参与前成骨细胞成骨分化过程,成骨分化前期主要在细胞质中表达,且参与小鼠胫骨形成。

葛根素通过下调miR-23a促进小鼠前成骨细胞增殖和分化的研究

目的探讨葛根素是否通过下调miR-23a促进小鼠前成骨细胞增殖和分化。方法将小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分为对照组、葛根素组、葛根素+miR-NC组和葛根素+miR-23a过表达组,RT-qPCR检测细胞中miR-23a的表达,CCK-8法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶活性检测葛根素对细胞活力的影响,Western blot检测细胞中Runx2蛋白的表达。应用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验验证miR-23a和Runx2的靶向调控关系。结果与对照组相比,葛根素组MC3T3-E1细胞增殖活性增强,细胞中miR-23a表达降低,Runx2蛋白表达水平升高(P<0.05);与葛根素+miR-NC组相比,葛根素+miR-23a过表达组MC3T3-E1细胞增殖活性降低,细胞中Runx2蛋白表达降低(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-23a靶向负调控Runx2的表达。结论葛根素促进小鼠前成骨细胞增殖和分化,机制可能与下调miR-23a进一步调控Runx2表达有关。

基于Wnt/β-连环蛋白信号通路探究金天格胶囊对肿瘤坏死因子α干预下前成骨细胞生物学功能的影响

目的:探讨基于Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路对金天格胶囊在肿瘤坏死因子α(TNF-α)干预下前成骨细胞生物学功能的影响。方法:取第4代MC3T3-E1细胞,将细胞分为正常组、TNF-α组(TNF-α15 ng/mL)、TNF-α+10μg/mL金天格组(TNF-α15 ng/mL+10μg/mL金天格胶囊)、TNF-α+20μg/mL金天格组(TNF-α15 ng/mL+20μg/mL金天格胶囊)、TNF-α+40μg/mL金天格组(TNF-α15 ng/mL+40μg/mL金天格胶囊)、Dickkopf相关蛋白1(DKK1)组(TNF-α15 ng/mL+40μg/mL金天格胶囊+0.1μg/mL Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1)、40μg/mL金天格组(40μg/mL金天格胶囊),各组细胞均使用相应药物共培养24 h。CCK8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测细胞上清白介素-6(IL-6)、IL-1β、IL-10水平;ALP试剂盒法检测细胞ALP活性;茜素红染色观察细胞矿化分化情况;qRT-PCR法和Western-Blot法检测细胞β-catenin、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)表达情况。结果:与正常组相比,TNF-α组细胞存活率、ALP活性、相对吸光度值、钙结节数量、上清IL-10水平、p-β-catenin、p-GSK-3β、RUNX2、OPG表达显著下降,细胞凋亡率、上清IL-6、IL-1β水平、RANKL表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);40μg/mL金天格组细胞存活率、ALP活性、相对吸光度值、钙结节数量、p-β-catenin、p-GSK-3β、RUNX2、OPG表达升高,细胞凋亡率、RANKL表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与TNF-α组相比,TNF-α+10μg/mL金天格组、TNF-α+20μg/mL金天格组、TNF-α+40μg/mL金天格组细胞存活率、ALP活性、相对吸光度值、钙结节数量、上清IL-10水平、p-β-catenin、p-GSK-3β、RUNX2、OPG表达显著升高,细胞凋亡率、上清IL-6、IL-1β水平、RANKL表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK1逆转了金天格胶囊对TNF-α刺激的前成骨细胞促增值和分化作用,并增加细胞凋亡和炎症反应。结论:金天格胶囊可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制TNF-α诱导的前成骨细胞的凋亡和炎症,促进细胞增殖和分化。

丹参对小鼠前成骨细胞的增殖分化的影响及其与细胞外信号调节激酶1／2信号通路的关系

目的观察丹参对于小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化及成骨活性的影响，探讨与细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）细胞信号通路的关系。方法分别用75、150、300 mg/L浓度的丹参注射液干预MC3T3-E1前成骨细胞，并设对照组；用细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞增殖活性的改变，培养21 d后茜素红染色法检测各组钙结节生成，实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法检测各组骨钙素（BGP）、Runt相关基因2（Runx2）mRNA表达。设300 mg/L浓度的丹参干预组和对照组，Western blot法检测磷酸化ERK1/2蛋白的表达；用ERK1/2细胞信号通路抑制剂PD98059抑制ERK通路后，FQ-PCR检测成骨相关基因BGP、Runx2基因mRNA表达。结果与对照组比较，丹参干预组的MC3T3-E1前成骨细胞增殖活性明显增强，其中300 mg/L浓度组作用最强（P＝0.006）。各浓度丹参干预组钙结节生成较对照组明显增多（P＝0.000），分别为（11.40±2.30）、（21.00±2.24）、（35.60±1.52）个，对照组为（6.40±1.14）个。各浓度丹参干预组的BGP mRNA相对表达量（1.02±0.04、1.11±0.07、1.26±0.05）较对照组增加，其中150 mg/L组以及300 mg/L组差异有统计学意义（P＝0.019，P＝0.000）；各浓度的丹参干预组的RunX2 mRNA相对表达量均有升高（1.38±0.25、2.28±0.13、2.48±0.06），并呈浓度依赖性，其中75 mg/L组差异有统计学意义（P＝0.012），150 mg/L组及300 mg/L组差异有统计学意义（P＝0.000）。经过丹参干预后（300 mg/L），磷酸化ERK1/2蛋白表达相对表达量为0.14±0.01，对照组为0.10±0.01，差异有统计学意义（P＝0.014）。300 mg/L丹参组、300 mg/L丹参＋PD98059组的BGPmRNA相对表达量分别为1.87±0.05、1.39±0.07，两组差异有统计学意义（P＝0.000）；Runx2表达的相对表达量分别为1.57±0.05、1.45±0.05，两组差异有统计学意义（P＝0.000）。结论丹参能促进成骨细胞增殖分化，增进矿化作用，作用机制可能与激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中的ERK1/2通路有关。