人乙型肝炎病毒前表面抗原(preS)基因的突变及其在家蚕细胞中影响表达的研究

为探讨人乙型肝炎病毒 (HBV)前表面抗原 (preS)基因的表达调控机理 ,以实现高效表达 ,利用PCR方法在克隆的 preS基因的第 2、3位密码子引入同义突变 ,消除存在于 5 '端编码区保守的反向重复序列 ,将 preS基因及其突变形式 (MpreS)分别重组到转移载体 pBM0 30 ,获得 pBM preS和pBM MpreS。将 pBM preS和 pBM MpreS分别与野生型家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)DNA共转染家蚕培养细胞 (BmN) ,经空斑筛选和杂交证实 ,分别获得重组病毒rBmNPV preS和rBmNPV MpreS。RNA点杂交和ELISA结果表明 :虽然在rBmNPV preS和rBmNPV MpreS感染的BmN细胞内都转录了 preS基因 ,但仅后者表达出 preS蛋白 ,提示preS基因的表达与基因内部起始区的反向重复序列密切相关。

人乙肝病毒前表面抗原PreS1在家蚕培养细胞中的表达

人乙肝病毒前表面抗原PreS1诱导的免疫反应可以克服机体对乙肝病毒S蛋白的无反应状态。将人乙肝病毒adr前表面抗原preS1基因克隆到杆状病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAKpreS1。用此转移载体与线性化病毒BmBacPAK6线性化基因组DNA共转染单层家蚕细胞(BmN),经细胞内同源重组和空白筛选,获得重组病毒。ELISA结果表明重组蛋白PreS1在家蚕培养细胞中的表达水平为02pg/个细胞,Western印迹证实此蛋白大小约为14kD。

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原阳性血清中提取病毒DNA ,采取PCR技术扩增出前表面抗原 (preS)基因片段 ,重组到质粒载体上 ,对该基因进行了全序列测定 [GenBank索取号CpreS HZ :AF 32 5 6 74;preS LZ :AF 32 5 6 75 ]。克隆的HBVpreS基因杭州分离物 (preS HZ)和兰州分离物 (preS LZ)全长 5 2 2个核苷酸 ,编码174个氨基酸。preS HZ与已发表的HBVadr亚型上海分离物[8] 、北京分离物[9] 、日本分离物[5] 、HBVadw亚型[10 ] 和ayw亚型[11] preS基因的核苷酸序列同源性分别为 96 .7%、96 .2 %、97.3%、88.7%和 84.1% ,氨基酸序列同源性分别为 96 .0 %、94.9%、97.1%、85 .1%和 85 .4% ;preS LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为 96 .4%、96 .2 %、96 .9%、88.7%、83 .7% ,氨基酸序列同源性分别为 94.9%、94.9%、96 .0 %、85 .1%、84.1%。分子进化分析 (DNASTAR ,1999)表明 ,克隆的两例HBVpreS基因属于adr亚型。preS LZ与preS HZ之间有两个核苷酸变异 (对应两个氨基酸变异 ) ,相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点。在免疫保护区内二者具有较好的保守性 ,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗。

表达含前S的乙肝病毒表面抗原重组CHO细胞株的建立和特性检测

为建立表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株,将笔者所在实验室构建的表达含前S基因乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的真核表达质粒共转染CHO/dhfr-细胞,通过筛选,获得可表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的重组CHO细胞,然后进行亚克隆,用氨甲喋呤(MTX)加压选择,以ELISA法检测目的蛋白表达量,筛选获得稳定表达目的蛋白的细胞株,并对其进行特性鉴定。最终获得了C10和A10两株稳定高表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株。

乙型肝炎病毒HBeAg与前S1抗原的相关性

目的：为了分析乙型肝炎前S1抗原在乙型肝炎病毒HbeAg和HBV-DNA阴阳性中的相关性,给临床治疗提供可靠的依据。方法：对我院2009年6月~2011年3月对300例乙型肝炎病人的血清进行了HBeAg和前S1抗原及HBV-DNA的ELISA双抗体夹心检测法和荧光定量法进行分析。结果：在检测乙型肝炎两对半阳性标本HbeAg阳性患者中,前S1抗原阳性率80%;HBeAg阴性患者中,前S1抗原阳性率28%。结论：在乙型肝炎HBeAg阴性病人中有相当一部分病人前S1抗原阳性,说明乙型肝炎病毒仍在复制中,乙型肝炎两对半病人检测中应该检测乙型肝炎前S1抗原。

人抗HBV-前S2抗体轻链基因的克隆及序列分析

目的获得人源性乙型肝炎病毒前Ｓ２抗体轻链基因。方法用人工合成的乙型肝炎病毒前Ｓ２短肽（Ｐｒｅ－Ｓ２，１２０—１４５），从已构建的人源性噬菌体抗体库中，得到了针对Ｐｒｅ－Ｓ２阳性克隆，经竞争抑制实验证明其特异性和活性，合成一对轻链引物，经ＰＣＲ扩增，亚克隆入质粒ＰＵＣ１８进行序列测定及分析、结果筛选到的阳性克隆具有乙型肝炎病毒前Ｓ２特异性亲和力。构建了ｐＵＣ１８－ Ｐｒｅ－Ｓ２ｋ。轻链重组质粒，序列分析其为人ｋ轻链，包括了完整的恒定区和可变区，大小为 ６４５ ｂｐ。结论利用抗原抗体特异性反应原理。

乙肝病毒入侵肝细胞的研究现状

目的:了解乙肝病毒入侵肝细胞的临床研究现状。方法:查阅文献,汇总资料中关于乙肝病毒入侵肝细胞的环节、病毒的结构及生命周期及乙肝病毒入侵的细胞分子等观点,从而了解乙肝病毒入侵肝细胞入侵点、机制等。结果:HBV的宿主特性和嗜肝性与肝细胞受体有关,病毒入侵肝细胞的关键部位是表面抗原前S1区,在S1区与其特异性结合的受体是NTCP。结论:全面深入研究HBV入侵肝细胞的分子机制,阻断病毒入侵,一直是临床研究的重点,也将为慢性HBV感染的防治提供巨大帮助。