大劣按蚊前酚氧化酶基因部分序列的克隆与序列分析

目的 克隆大劣按蚊 (Anophelesdirus)前酚氧化酶 (Prophenoloxidase,PPO)基因部分序列。 方法 根据已报道的多种昆虫 PPO的保守氨基酸序列设计简并引物 ,以大劣按蚊总 RNA为模板进行 RT- PCR扩增 ,目的片段经 TA克隆后测定其核酸序列 ,然后进行序列查询与比对。 结果 大劣按蚊 PPO基因 (Ad PPO)部分序列长 5 98bp,编码 199个氨基酸 ;Ad PPO与冈比亚按蚊 PPO5基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达 84 .2 3%和 88.89%。 结论 成功克隆出Ad PPO部分序列 ,其与冈比亚按蚊 PPO基因序列具有很高同源性。

按蚊中肠前酚氧化酶原与约氏疟原虫卵囊黑化的关系

目的 分析约氏疟原虫卵囊黑化期间按蚊中肠内前酚氧化酶原 (Prophenoloxidase ,PPO)的变化 ,探讨中肠PPO与疟原虫卵囊黑化的关系。 方法 解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后 3、5、7、11和 15d斯氏与大劣按蚊中肠 ,匀浆后经SDS PAGE和转膜 ,以抗烟草天蛾PPO的抗体进行免疫印迹分析 ,并于感染后第 5d开始在镜下观察约氏疟原虫卵囊黑化情况 ,直至第 15d止。 结果 斯氏与大劣按蚊中肠在约氏疟原虫感染前和感染后的不同时期经免疫印迹均可检测到 1条分子质量约为 67ku的PPO阳性蛋白带 ,但感染后的PPO蛋白带比感染前明显增强 ,而且同时间点大劣按蚊中肠PPO蛋白带比斯氏按蚊明显 ,尤其在感染的后期大劣按蚊中肠PPO蛋白带明显比斯氏按蚊增强 ;在感染后 7d可见大劣按蚊中肠内发育的约氏疟原虫卵囊部分黑化 ,在 15d时可见疟原虫卵囊完全黑化。 结论 按蚊中肠PPO含量增加 ,尤其是长时间内维持在较高水平与约氏疟原虫卵囊黑化密切相关。

约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶的变化

目的 比较分析约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶 (prophenoloxidase ,PPO)的分布及其变化 ,探讨中肠PPO与按蚊抗疟原虫感染免疫防御反应的关系。方法 解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后 3、5、7、11和 15d斯氏按蚊与大劣按蚊的中肠。利用烟草天蛾PPO抗体分别进行免疫组化染色和免疫印迹分析。结果 斯氏按蚊与大劣按蚊在未感染约氏疟原虫前的中肠循环管道内均已存在PPO ,而感染后循环管道内的PPO扩散到中肠组织间隙并聚集成片状、块状或条索状 ,大劣按蚊中肠PPO的聚集程度大于斯氏按蚊 ;在感染前和感染后不同时期免疫印迹均可检测到斯氏按蚊与大劣按蚊中肠PPO蛋白带 ,分子量约为 67× 10 3,感染后的PPO蛋白带型比感染前明显增强 ,而且大劣按蚊中肠PPO蛋白带型比斯氏按蚊尤为明显。结论 约氏疟原虫感染前按蚊中肠循环管道内存在的PPO可能是经与血淋巴相通的循环管道扩散而来 ,感染后导致的中肠内PPO不同分布及其变化可能与疟原虫感染按蚊密切相关 。

斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶差异表达与疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的 探讨斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系。方法 斯氏按蚊分吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组 ,挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴 ,解剖后取吸硝喹糖水蚊第 1、2和 3天斯氏按蚊中肠 ,超声提取中肠蛋白 ,Bradford法检测血淋巴总蛋白浓度 ,继而对血淋巴和中肠蛋白进行SDS -PAGE ,Western印迹电转移后检测前酚氧化酶。结果 四组血淋巴前酚氧化酶和用药后中肠前酚氧化酶均呈现一条阳性蛋白带 ,分子量分别均约 6 6kDa,与吸糖水组比较 ,吸正常小白鼠血组血淋巴前酚氧化酶表达增强 ,而感染后血淋巴前酚氧化酶表显著增强。硝喹诱导黑化后血淋巴前酚氧化酶表达水平呈逐日下调趋势 ,而硝喹诱导黑化过程中中肠前酚氧化酶量逐渐增加。结论 斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶参与疟原虫卵囊黑化反应。

中华按蚊前酚氧化酶基因部分序列的基因结构和功能预测

前酚氧化酶是一种黑色素合成酶，是节肢动物体内的一种重要免疫蛋白。为了克隆中华按蚊Anophelessinensis前酚氧化酶（Prophenoloxidase，PPO）基因部分序列，根据已报道的多种昆虫PPO氨基酸的保守序列设计简并引物，以中华按蚊总RNA为模板进行RT—PCR扩增，目的片段经TA克隆后测序。所得中华按蚊PPO基因（ASPPO）部分序列长597bp，编码199个氨基酸；与几种近缘蚊种的PPO基因序列同源性分别达57％～100％不等。经在线比对，该序列在基因组中分属两个外显子区域，中间含有一个内含子。推导的氨基酸序列含有两个铜离子结合位点，与目标序列相符，表明成功克隆出ASPPO部分序列。所得序列登录GenBank，登录号：JX295575，JX295576。推导的氨基酸序列提交瑞士蛋白质空间构象模拟平台Swiss-model，以冈比亚按蚊免疫相关前酚氧化酶为模板进行空间3D构象模拟，SPDview软件分析拉氏构象图。结果显示拉氏构象得分较高而QMEAN得分较低，近似跨膜蛋白值，提示该该蛋白是否为中华按蚊中肠和血淋巴疟原虫免疫蛋白尚不确定，需进一步研究。

约氏疟原虫卵囊黑化期间大劣按蚊血淋巴蛋白的分析

目的 初步探讨大劣按蚊 (Anophelesdirus)黑化包被约氏疟原虫 (Plasmodiumyoelii)卵囊相关蛋白。方法 挤压法分别收集血餐后第 1、3、4、5天时不吸血组、吸正常血组和感染组的雌大劣按蚊血淋巴 ,经SDS PAGE分离后 ,银染显色。同时 ,用烟草天蛾 (ManducaSexta)前酚氧化酶 (Prophenoloxidase ,PPO)亚基 1IgG检测正常雌大劣按蚊血淋巴中的PPO。结果 SDS PAGE发现感染约氏疟原虫后 ,部分大劣按蚊的血淋巴蛋白带增强 ,而部分血淋巴蛋白带却减弱 ,免疫印迹发现大劣按蚊血淋巴PPO有 87× 10 3 、6 7× 10 3 、6 3× 10 53条蛋白带 ,而相应分子量的 3条蛋白带在约氏疟原虫感染后第 4、5天开始增强 ,其中尤以 87× 10 3 的增强最为明显。

大劣按蚊AdPPO2、AdPPO3基因cDNA克隆与组织定位

目的 克隆大劣按蚊PPO基因家族新成员的cDNA部分序列 ,并对所克隆基因进行蚊体组织定位研究。方法 根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物 ,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT PCR扩增、目的片段克隆入T载体 ,然后 ,用PCR方法筛选新的PPO克隆并测序 ;以RT PCR方法分析AdPPO2和AdPPO3在蚊血淋巴、蚊胃和唾液腺的分布情况。结果 AdPPO2和AdPPO3基因cDNA部分序列长均为 5 97bp ,编码 199个氨基酸 ;它们在血淋巴、蚊胃和唾液腺均有分布。结论 从大劣按蚊成功克隆获得 2种新的PPO基因家族成员的cDNA部分序列 。

约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO4基因转录与卵囊内Ca^(2+)的影响

目的 观察约氏疟原虫感染对大劣按蚊前酚氧化酶 (prophenoloxidase ,PPO)基因转录的影响与卵囊黑化期间囊内Ca2 + 的变化 ,探讨疟原虫感染不易感蚊种时卵囊黑化的相关机制。方法 分别在大劣按蚊吸血感染约氏疟原虫前与感染后 1、2、3和 5d抽提蚊总RNA进行RT PCR ,PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后扫描进行凝胶图像分析 ,并对所得数据进行统计学处理。在吸血感染后 5、7、11和 15d解剖分离按蚊中肠 ,以荧光染料Fluo 3 Am作为卵囊内Ca2 + 指示剂 ,利用共聚焦扫描显微镜观察不同时期约氏疟原虫卵囊内Ca2 + 的分布及变化。结果 吸血感染约氏疟原虫前大劣按蚊PPO4基因的RT PCR扩增产物较少 ,但感染后明显增加 (P <0 0 1) ,尤其在感染后 1d与 2d最为明显 ;约氏疟原虫未黑化卵囊内Ca2 + 为( 13 7 15± 7 0 2 )nmol L ,完全黑化卵囊内Ca2 + 为 ( 18 44± 1 75 )nmol L、并在囊壁出现明显的钙沉着。结论 吸血感染约氏疟原虫后大劣按蚊PPO4基因转录比感染前明显增强 ,黑化卵囊内Ca2 + 较未黑化卵囊明显减少 。

AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析

目的 克隆大劣按蚊 (Andirus)前酚氧化酶 (prophenoloxidase ,PPO)基因部分序列。方法 根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物 ,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT PCR扩增 ,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列 ,然后进行序列查询与比对。结果 从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长 5 97bp ,编码 199个氨基酸 ;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达 84%和 90 %。结论 从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列 。

斯氏按蚊PPO1基因克隆及其与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的克隆和分析斯氏按蚊前酚氧化酶基因与约氏疟原虫卵囊黑化关系。方法根据其他昆虫前酚氧化酶基因的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊RNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm-T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定。根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下前酚氧化酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位及与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析。结果获得了1种斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶基因cDNA部分序列,即AsPPO1(600bp),分别与冈比亚按蚊PPO1和大劣按蚊PPO2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含PO保守的铜结合位点CuA(HHWHWHLVYP)序列。在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血淋巴有AsPPO1mRNA表达。结论As-PPO1很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关。

约氏疟原虫感染斯氏按蚊后血淋巴PPO的酶解激活

目的 了解约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊是否发生黑化相关性酶级联反应。方法 挤压法收集雌斯氏按蚊成蚊血淋巴 ,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度 ,然后对血淋巴进行一维和二维SDS PAGE ,继而利用Western印迹分析比较PPO蛋白点的差异。结果 约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊之前的血淋巴蛋白二维凝胶电泳后的Western印迹的PVDF膜上出现 2个分子量均约为 64× 10 3、等电点分别约为 7 4和 7 6的两个PPO蛋白点 ,感染后发现 8个蛋白点 ,3 6×10 3分子量处 3个 ,等电点分别约为 7 2、7 4和 8 0 ;3 0× 10 3分子量处 5个 ,等电点分别约为 7 0、7 2、7 5、7 6和 7 8。结论 约氏疟原虫感染雌斯氏按蚊成蚊之前的血淋巴PPO以异二聚体形式结构性表达于血淋巴内 ,感染后PPO发生免疫激活反应和酶学分解过程 ,提示PPO参与疟原虫卵囊黑化包被反应。

吸血和约氏疟原虫感染对AdPPOs基因家族转录水平的影响

目的 观察血餐和约氏疟原虫感染对AdPPO1、AdPPO2和AdPPO3基因转录水平的影响。方法 同批 3～ 5d龄大劣按蚊分为不吸血组 (N)、吸正常血组 (NB)和吸感染血组 (IB) ,在血餐后 2 4h分别制备各组蚊总RNA ,所有样品进行RT PCR后 ,各吸取 10 μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶图像分析系统扫描并读取数据 ,并对所得数据进行统计学处理。结果 与不吸血组比较 ,吸血组和感染组AdPPO1的转录水平显著下降 (P <0 0 5 ) ,但吸血组和感染组间没有显著性差异 (P >0 0 5 )。吸血组AdPPO2的转录则明显上调 (P <0 0 5 ) ,但与感染组间没有显著性差异 (P >0 0 5 ) ;AdPPO3基因的转录水平在 3组间均没有显著性差别 (P >0 0 5 )。结论 血餐明显抑制AdPPO1基因的转录 ,但明显上调AdPPO2基因的转录水平 ;约氏疟原虫感染后 2 4h ,AdPPO1。

一种新的(1→3)-β-D-葡聚糖识别蛋白的鉴定及其分子克隆

目的从大黄粉虫 (Tenebriomolitor)体内鉴定出一种 (1→ 3) β D 葡聚糖识别蛋白 (Tm GRP)并对其进行分子克隆。方法通过制备一种 β 1,3 葡聚糖固定化柱 ,从大黄粉虫的体液中筛选出能与 (1→ 3) β D 葡聚糖发生特异性结合的蛋白质。利用DNA探针法和随机引物法从大黄粉虫的cDNA文库中筛选Tm GRP的全部DNA序列。结果Tm GRP是一个由 14 4 3个核苷酸编码产生的具有 4 81个氨基酸残基的蛋白质。结论Tm GRP是大黄粉虫体内的一种葡聚糖识别蛋白。

水产甲壳动物的免疫防御机能及其免疫预防研究进展

对国内、外关于水产甲壳动物免疫防御机能及其免疫预防研究状况进行了综述。甲壳动物免疫细胞主要依靠吞噬和包围化作用发挥其防御机能 ,而酚氧化酶前体 (proPO)活化系统、植物凝血素和杀菌素等免疫防御有关的液性因子主要起杀菌和促进细胞吞噬的作用。通过免疫接种诱导水产甲壳动物产生的免疫应答主要是非特异性免疫应答。