高效液相色谱测定邻位酪氨酸样品前处理研究

对高效液相色谱法检测禽肉类辐照食品中邻位酪氨酸的前处理方法进行了研究,考察脂肪、水分及充氮条件对测定结果的影响;在单因素实验的基础上,以盐酸浓度、水解温度、时间及苯酚为因素,进行正交实验。结果表明,测定邻位酪氨酸的最佳样品前处理条件为:去脂肪、去水分,在充氮条件下,以2mol/L盐酸在(110±1)℃的恒温干燥箱内水解24h。

正电子发射显像剂O-(2-[^(18)F]氟乙基)-L-酪氨酸的新型前体的合成

设计合成了5种新型正电子发射断层显像剂O-(2-[18F]氟乙基)-L-酪氨酸的前体化合物:N-叔丁氧羰基-O-(2-甲磺酰/对硝基苯磺酰)-氧乙基-L-酪氨酸甲酯(9a,11a)和N-叔丁氧羰基-O-(2-甲磺酰/对甲苯磺酰/对硝基苯磺酰)-氧乙基-L-酪氨酸叔丁酯(9b,10b,11b)。这些化合物以L-酪氨酸为原料,先与甲醇发生酯化反应或与乙酸叔丁酯进行酯交换,再用叔丁氧羰基保护氨基,最后以碳酸钾为碱、18-冠-6为相转移催化剂与乙二醇的磺酸酯在丙酮溶液中加热回流形成目标化合物,总收率为30%～67%。

高效液相色谱测定邻位酪氨酸样品前处理

研究前处理条件对高效液相色谱法检测禽肉类辐照食品中邻位酪氨酸的测定结果的影响。考察脂肪、水分及充氮条件对测定的影响;在单因素试验的基础上以盐酸浓度、水解温度、时间及苯酚为因素对测定影响做了正交试验。结果表明测定邻位酪氨酸的最佳样品前处理条件:去脂肪、去水分,在充氮条件下,以2mol/L盐酸,在110±1℃的恒温干燥箱内,水解24h。

穹隆海马伞切断与卵巢切除大鼠大脑皮质和海马CA1区酪氨酸激酶A与淀粉样β蛋白前体β位点裂解酶共存观察

目的:观察穹隆海马伞切断加卵巢切除大鼠大脑皮质区、海马CA1区酪氨酸激酶A与淀粉样β蛋白前体β位点裂解酶共存表达的变化。方法:实验于2003-03/12在青岛大学医学院附属医院脑病防治重点实验室完成。选择成年健康雌性Wistar大鼠14只,随机分为穹隆-海马伞切断加卵巢切除组和对照组,每组7只。穹隆海马伞切断参照Klein等的方法,动物麻醉固定于脑立体定位仪后,参照Paxinos等大鼠脑立体定位图谱于前囟后2.2～2.5mm,中线外1.0mm处凿开颅骨,切开硬脑膜,自制双刃刀完全切断海马伞外侧缘。双侧卵巢切除参照Singh等的方法,麻醉动物后,打开腹腔,在肾脏下方的脂肪内取出卵巢,结扎并切除。对照组除不切断穹隆-海马伞和不切除卵巢外,其余步骤同穹隆-海马伞切断加卵巢切除组。免疫荧光双标细胞化学染色,激光共聚焦显微镜下观察大鼠大脑皮质区、海马CA1区酪氨酸激酶A、淀粉样β蛋白前体β位点裂解酶阳性细胞表达及其共存表达的变化。结果:实验过程中,无动物死亡,全部进入结果分析。穹隆-海马伞切断加卵巢切除组大鼠大脑皮质区、海马CA1区酪氨酸激酶A绿色荧光细胞数与对照组比较显著减少[皮质区(11.85±8.11),(22.14±8.68),P<0.05];[海马CA1区(11.28±3.04),(17.28±5.85),P<0.05]。淀粉样β蛋白前体蛋白β位点裂解酶红色荧光细胞数与对照组比较显著增多[皮质区(21.14±6.20),(5.57±3.10),P<0.01];[海马CA1区(12.43±6.24),(3.42±2.76),P<0.01]。海马CA1区呈现黄色荧光的双标细胞数与对照组比较显著增多[(5.71±3.64),(0.57±1.51),P<0.01],大脑皮质区呈现黄色荧光的双标细胞数与对照组比较,差异无显著性意义[(5.71±3.14),(2.85±3.07),P>0.05]。结论:穹隆海马伞切断加卵巢切除大鼠大脑皮质区、海马CA1区出现淀粉样β蛋白前体β位点裂解酶表达增多、酪氨酸激酶A表达减少,海马CA1区共存细胞表达增多现象,说明神经生长因子系统与淀粉样β蛋白前体系统可能存在内在的相互联系。

含C-src同源序列的酪氨酸磷酸酶SHP-2和SHP-1在前列腺增生组织重构中的表达

目的:探讨含C-src同源序列的酪氨酸磷酸酶SHP-2和SHP-1在前列腺增生组织重构中的表达及意义。方法:采用免疫组化En Vision二步法检测10例正常前列腺组织、30例良性前列腺增生组织(BPH)、20例前列腺上皮内瘤变(PIN)、20例高分化前列腺癌(Pca)和10例低分化前列腺癌组织中SHP-2和SHP-1的表达。结果:SHP-2在正常组中主要表达在基底和上皮细胞的胞浆中,少数在胞核中表达;在BPH组中基底和上皮细胞的胞浆和胞核中均有表达;在PIN、高分化Pca和低分化Pca组中主要在细胞核内表达,少数在胞浆中表达。SHP-2在各组的平均染色指数分别为0.4、1.7、2.1、2.2和2.6。SHP-1在正常前列腺组织,BPH、PIN和高分化Pca的组织细胞的胞浆中均有不同程度表达,在低分化Pca组织中不表达;SHP-1在各组的平均染色指数分别为1.8、1.8、1.5、1.2和0.4。结论:在前列腺组织细胞增殖、分化及转化过程中,存在SHP-1和SHP-2相关的信号传导的改变。SHP-2异常激活和表达部位的改变可能是导致前列腺组织重构、增生及癌变的重要机制。

大鼠脑出血后不同时期神经营养因子受体p75、神经生长因子前体、酪氨酸激酶A的表达及其与细胞凋亡的相关性

目的研究脑出血后血肿周围组织中神经营养因子受体p75(p75NTR)、神经生长因子前体(proNGF)、酪氨酸激酶A(TrkA)的表达及细胞凋亡率,进一步探讨其在脑出血后的细胞凋亡中所发挥的作用。方法制作大鼠脑出血模型,于术后6h、24h、72h、10d处死各组大鼠获取所需脑组织标本,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化SP法检测p75NTR、TrkA、proNGF的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测p75NTR、TrkA的基因表达水平。结果脑出血后p75NTR、proNGF表达水平及p75NTR/TrkA值与对照组比较显著升高(P<0.01),且动态变化规律与脑细胞凋亡率相似;72h后TrkA的动态变化规律与细胞凋亡率相反。结论脑出血后proNGF与p75NTR的结合可能参与介导脑细胞凋亡,p75NTR/TrkA值增高时,proNGF及p75NTR以介导细胞凋亡为主;TrkA在脑出血后72h内神经营养作用被抑制,72h后可能发挥神经营养作用。

高效液相色谱法检测γ-射线辐照食品中的邻酪氨酸

目的:建立含蛋白质辐照食品中邻酪氨酸的柱前衍生-高效液相色谱检测方法。方法:样品经丙酮-三氯甲烷溶液净化除去脂肪和糖分,在110℃经盐酸水解过夜去蛋白后,水解液与衍生剂衍生,高效液相色谱检测,外标法定量。结果:方法最低检出限为5mg/kg,样品在5、10、50mg/kg添加水平的平均回收率为62.1%～88.3%,变异系数为3.91%～9.38%(n=6)。结论:辐照剂量在5kGy及以上的鸡肉和猪肉可以被检测出邻酪氨酸,含量明显高于空白,且邻酪氨酸含量与辐照剂量呈线性关系。辐照剂量在5kGy及以上的鸡肉和猪肉在-20℃中保存3个月后仍可以检测出邻酪氨酸。

三酶偶联全细胞生物合成L-酪氨酸

通过将醛缩酶(ALD)、D-丝氨酸脱水酶(SDH)和酪氨酸酚裂解酶(TPL)三酶偶联,催化甘氨酸、甲醛和苯酚合成L-酪氨酸(L-Tyr)。并以L-Tyr的质量浓度为指标对转化工艺进行了考察。结果表明:三酶偶联最佳反应条件为pH=8.5、温度35℃、乙酸铵质量分数6 g/L、磷酸吡哆醛(PLP)质量浓度0.1 g/L、3种酶细胞配比m(ALD)∶m(SDH)∶m(TPL)=6∶3∶5。当甘氨酸加量为50 g/L,利用上述工艺进行10000 L放大,反应11 h,L-Tyr质量浓度可达117 g/L,苯酚转化率为97%,转化体系放大后苯酚转化率提高4%,收率为85%。

酱油和腐乳中致突变前体物—酪胺的研究

酪胺对人体是1种有害的质，慢性少量摄入体内有形成内源性致突变物3-重氮酪胺的危险．已证明3-重氮酪胺在动物体内有致癌性，食品中的酪胺是蛋白质分解产生的酪氨酸在微生物的作用下经脱羧反应后形成的．1984年日本学者Masako，Ochiai，报道了酪胺是酱油中的1种主要致突变前体物，用生理浓度(1—3mM)的亚硝酸盐处理酱油也能形成致突变性．

环状RNA含有16A的脱水酶结构域分子-微小RNA-1237-5p-细胞凋亡相关酪氨酸激酶轴调控乳腺癌细胞密歇根癌症基金会7号细胞凋亡

目的观察环状RNA含有16A的脱水酶结构域分子(circRNA ABHD16A)-微小RNA(miRNA,miR)-1237-5p-细胞凋亡相关酪氨酸激酶(AATK)轴对乳腺癌细胞密歇根癌症基金会7号细胞(MCF-7)凋亡的影响.方法运用中国科学引文数据库(CSCD)和Target Scan在线分析分别分析ABHD16A与miR-1237-5p和miR-1237-5p与AATK的相关性.利用Luciferase assay检测circRNA ABHD16A是否靶向miR-1237-5p以及miR-1237-5p是否靶向AATK.在过表达或敲低circRNA ABHD16A的情况下,通过蛋白质印迹法(Western blot)检测AATK和乳腺癌细胞MCF-7凋亡标志蛋白表达;通过噻唑蓝(MTT)实验分析乳腺癌细胞MCF-7的细胞活力;通过磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V)染色检测乳腺癌细胞MCF-7的凋亡水平.Student's t检验分析两组单向方差分析.结果circRNA ABHD16A靶向miR-1237-5p;miR-1237-5p靶向AATK3'UTR的320-326和469-475区域.过表达ABHD16A时,AATK的表达量明显上升(t=15.295,P<0.01),细胞凋亡相关蛋白bcl-2拮抗剂(bak),bcl-2相关X凋亡调节因子(bax)和被切割的胱天蛋白酶9(cleaved-Cas9)的表达量明显上升(t=7.403、8.381、21.583,P<0.01),而bcl-2细胞凋亡调节剂(bcl-2)的表达量明显下降(t=6.301,P<0.01),MCF7细胞活力水平下降(t=17.392,P<0.01),凋亡水平上升(t=8.491,P<0.05).敲低ABHD16A时,AATK的表达量明显下降(t=9.290,P<0.01),细胞凋亡相关蛋白bak、bax和cleaved-Cas9的表达量明显下降(t=8.381、5.296、11.492,P<0.01),而bcl-2的表达量明显上升(t=5.609,P<0.01),MCF7细胞活力水平上升(t=5.694,P<0.01),凋亡水平下降(t=13.502,P<0.01).结论circRNA ABHD16A靶向miR-1237-5p后增加AATK的表达量,并促进乳腺癌细胞MCF-7凋亡.

萎胃消对萎缩性胃炎癌前病变患者PTEN和ERK_2蛋白表达的影响

目的:观察萎胃消对慢性萎缩性胃炎伴胃黏膜上皮异型增生或/和不完全型结肠上皮化生的治疗效果及PTEN和ERK2蛋白表达的影响。方法:60例患者随机分为治疗组和对照组。治疗组给予萎胃消颗粒,对照组给予维酶素,疗程3个月。观察临床症状和体征、胃镜和病理组织学变化及PTEN和ERK2的表达。结果:治疗前后症状缓解总有效率:治疗组90.00%,对照组55.67%;胃镜和病理改变总有效率:治疗组70%,对照组33.33%;2组间比较差异均有显著性(P<0.01)。PTEN和ERK2表达:治疗组治疗前后PTEN和ERK2表达差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而对照组治疗前后PTEN和ERK2表达水平变化不明显。结论:萎胃消具有良好的胃癌前病变逆转治疗效应,其上调抑癌基因蛋白PTEN的表达和有效抑制ERK信号通路的异常激活可能是萎胃消治疗萎缩性胃炎癌前病变的部分作用机理。

欣胃颗粒对胃癌前病变大鼠STAT3、p-STAT3信号通路的影响

目的探讨欣胃颗粒对胃癌前病变(precancerous lesionof gastric cancer,PLGC)大鼠信号传导及转录活化因子(signal transducers and activators of transcription,STATs)、酪氨酸磷酸化STAT3(p-STAT3)信号通路的影响。方法 96只Wistar大鼠随机分为空白对照组(空白组)16只,造模组80只。采用N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(MNNG)为主的复合因素造模法制备PLGC大鼠模型,将造模成功大鼠随机抽取75只分为模型组、维霉素组、欣胃颗粒低剂量组、欣胃颗粒中剂量组、欣胃颗粒高剂量组,每组15只。空白组随机抽取大鼠15只。空白组予普通标准饲料喂养,并予10mL/kg生理盐水灌胃;欣胃颗粒低、中、高剂量组每日分别给予1.254、2.508、5.016g/kg中药冲剂灌胃;模型组给予10mL/kg生理盐水灌胃;维酶素组将维酶素片研碎制成0.1g/mL的混悬液以10mL/kg灌胃。均每日1次,给药12周。观察各组大鼠的一般状态(包括大鼠皮毛、活动度、进食进水量、粪便、体重及存活情况)和胃黏膜组织病理学的变化,观察其对STAT3、p-STAT3表达的影响。结果与空白组比较,模型组STAT3、p-STAT3表达水平增高(P<0.05)。欣胃颗粒各剂量组大鼠活动度、进食水量、体重等一般状态较模型组好转;与模型组比较,欣胃颗粒低、中、高剂量组,STAT3、p-STAT3表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);PLGC即肠上皮化生(intestinal metaplasia,IM)和异性增生(dysplasia,DYS)发生率均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与维酶素组比较,欣胃颗粒中、高剂量组IM及DYS发生率均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),欣胃颗粒中、高剂量组STAT3、p-STAT3表达水平下降更显著,差异有统计学意义(P<0.05)。结论欣胃颗粒对PLGC大鼠胃黏膜组织病理具有明显改善作用,可下调STAT3、p-STAT3的表达以达到对抗PLGC的作用。

脑卒中后抑郁大鼠额前皮质脑源性神经营养因子和酪氨酸激酶受体B蛋白的表达变化

目的 探讨脑卒中后抑郁（PSD）大鼠额前皮质脑源性神经营养因子（BDNF）和其高亲和力受体酪氨酸激酶B（TrkB）蛋白的表达变化.方法 利用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型、加以慢性不可预见的中等应激刺激和孤养方法造成PSD动物模型,并与正常对照组、脑卒中组及抑郁组作比较.每组6只动物,应用免疫组化检测各组大鼠造模后第29天大脑额前皮质BDNF和TrkB阳性细胞数的表达变化.结果 PSD组额前皮质BDNF阳性细胞数最少[（21.00±12.41）个/视野]；但各组相比差异无统计学意义（P＞0.05）.PSD组大鼠额前皮质TrkB阳性细胞数最少[（20.78±7.20）个/视野],抑郁组次之[（21.00±5.61）个/视野],脑卒中组最多[（31.67 ±7.38）个/视野]；单因素方差分析结果显示PSD组和抑郁组与脑卒中组比较,均差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 PSD大鼠额前皮质TrkB蛋白的表达减少可能与PSD发病机制直接相关.

Genistein对大鼠垂体前叶细胞增殖的抑制作用

应用细胞培养、3H TdR掺入、流式细胞和电镜技术 ,观察酪氨酸蛋白激酶 (PTK)抑制剂genistein对正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT 2 0增殖的影响 ,并探讨其可能的机制。结果显示 :genistein作用 48h后可明显抑制正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT 2 0增殖。流式细胞仪检测发现 ,5 0和 10 0 μmol/Lgenistein可将AtT 2 0细胞阻断于G0 /G1期及G2 /M期 ,并出现凋亡峰 ,凋亡率分别达 19 9%和 36 4%。电镜照片显示有凋亡细胞。结果表明 ,PTK抑制剂可以明显抑制正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT 2 0的增殖 ,并诱导细胞凋亡 。

脑卒中后抑郁大鼠额前皮质脑源性神经营养因子及酪氨酸激酶受体B表达的变化

目的探讨脑卒中后抑郁（PSD）大鼠额前皮质脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA和其高亲和力受体酪氨酸激酶受体B（TrkB）mRNA的表达变化。方法利用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型、加以慢性不可预见的中等应激刺激和孤养方法造成PSD动物模型，并与正常对照组、脑卒中组及抑郁组作比较，每组8只动物。应用RT-PCR检测各组大鼠造模后第29天大脑额前皮质BNDF和TrkBmRNA的表达变化，以GADPH为内参。结果PSD组额前皮质BNDFmRNA表达最少（0．75±0．21）；正常对照组BDNFmRNA的表达最多（0．83±0．16）；抑郁组BDNFmRNA的表达量为（0．77±0．22）；脑卒中组BDNFmRNA的表达量为（0．80±0．20）。单因素方差分析结果显示：PSD组BDNFmRNA的表达较正常对照组和脑卒中组低（P〈0．05）；各组TrkBmRNA的表达相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论PSD大鼠额前皮质BDNFmRNA表达减少可能与PSD发病机制相关。

OPA柱前自动衍生HPLC-FLD法测定玉米低聚肽中AY的含量

研究建立了反相高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)测定玉米低聚肽中丙氨酸-酪氨酸(AY)的方法。色谱柱选为Agilent Hypersil ODS柱(125 mm×4.6 mm×5μm);荧光检测激发波长为340 nm,发射波长为450 nm;洗脱程序为梯度洗脱,流速为1.0 mL/min。玉米低聚肽样品经邻苯二甲醛(OPA)柱前自动衍生,能使AY与样品中游离氨基酸、小肽等在30 min内得到良好分离,并且AY浓度在0.1～1 000.0 mg/L时其浓度与相应峰面积有良好的线性关系,最低检测限(以信噪比为3计)为0.005 mg/L。样品加标各AY的回收率为97.8%。该法快速准确,简便灵敏,分离度高,能够满足玉米低聚肽中AY的检测要求。

积雪草酸改善小鼠脂肪细胞胰岛素抵抗的机制研究

目的:观察番石榴叶三萜化合物积雪草酸对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化以及胰岛素抵抗脂肪细胞糖脂代谢的影响并探讨其作用机制。方法:MTT法检测药物对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响;油红O染色法观察药物对其分化的影响。地塞米松诱导建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型,药物干预后采用葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖消耗量;比色法检测游离脂肪酸浓度;ELISA法检测脂联素水平;Western blotting法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)蛋白表达的变化。结果:与溶媒对照组相比,积雪草酸在10～100μmol/L时能显著促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,但明显抑制其分化(P<0.05或P<0.01);在30和100μmol/L时,无论是基础状态还是胰岛素刺激状态,均能显著增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗,减少游离脂肪酸的产生(P<0.05);其对胰岛素抵抗脂肪细胞的脂联素分泌和PPARγ蛋白表达无明显影响(P>0.05),但能显著下调PTP1B蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:积雪草酸能显著改善脂肪细胞胰岛素抵抗,增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗和减少游离脂肪酸的产生,其机制可能是其下调胰岛素信号转导的负性调节因子PTP1B的表达,增强胰岛素信号转导,从而改善胰岛素抵抗。

柱前衍生HPLC法分析榅桲多糖中单糖组成及PTP1B抑制活性

目的建立柱前衍生反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定榅桲多糖中单糖的组成及摩尔比,检测榅桲多糖的蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制活性。方法采用水提醇沉法提取榅桲多糖,并用PTP1B体外模型进行抑制活性测定。榅桲多糖样品经三氟醋酸(TFA)(2 mo1.L-1)和硫酸(2 mo1.L-1)的混合溶液降解为单糖后,经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化,利用RP-HPLC法,检测单糖的PMP衍生物。结果榅桲多糖中含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等单糖,摩尔比为0.10∶0.72∶1.12∶4.23∶4.73。榅桲多糖具有良好的PTP1B抑制活性,其IC50为2.068μg.mL-1,初步推测榅桲多糖具有抗Ⅱ型糖尿病的潜力。结论该方法具有简便、快速、重现性好的特点,可用于榅桲多糖的单糖组成分析及质量控制。

高危肾细胞癌术前新辅助靶向药物治疗

肾细胞癌对化疗和放疗均不敏感,对细胞因子治疗的反应率亦不到20%。近年来,针对肿瘤血管生成抑制剂出现极大地改变了肾癌的治疗模式。通过术前新辅助靶向药物治疗高危肾癌的可以使得肿瘤缩小,增加手术切除成功率,提高肾癌患者的生存率。同时可显著降低肾癌瘤栓长度,可减少肿瘤负荷,帮助双侧肾癌及孤立行肾保留肾单位手术(NSS)或根治性切除术安全实施。但也必须认识到这种治疗方法的局限性,增加更多的临床研究获得更加可靠的数据。

大鼠垂体前叶中的TH-,ChAT-免疫阳性神经纤维

长期以来，人们一直认为垂体前叶腺细胞没有直接神经支配，前叶内只有自主神经纤维支配垂体前叶的血管。本文在大鼠垂体的相邻切片上，应用免疫组织化学技术，对前叶中的儿茶酚胺的特征性酶——酪氨酸羟化酶（ＴＨ）和乙酰胆碱的特征性酶——胆碱乙酰转移酶（ＣｈＡＴ）进行显色。结果显示，大鼠垂体前叶中存在着ＴＨ－和ＣｈＡＴ－免疫阳性神经终末，两者可同时分布于垂体前叶的同一区域，且有较多终末分布于腺细胞周围。