应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因

目的:乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白是由HBV S基因编码的具有多种功能的蛋白质.前-S2蛋白的表达对于HBV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究前-S2蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1 (-)和pcDNA3.1(-)-preS2分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析. 方法:以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号: AF384371)作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增前-S2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-preS2.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA事列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有42个基因表达水平显著上调,36个基因表达水平显著下调. 结论:HBV的前-S2蛋白是一种反式激活因子,前-S2基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.

乙型肝炎病毒前-S2蛋白结合蛋白基因S2-29的克隆化研究

目的:筛选人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白(Pre-S2)相互作用的蛋白,探寻HBV致病机制。方法:用多聚酶链反应(PCR)技术扩增HBV前-S2基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,用营养缺陷型培养基及蓝白斑双重筛选阳性菌落,提取酵母质粒转化大肠杆菌并测序,进行生物信息学分析。逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法从HepG2细胞的mRNA中扩增出完整的新基因S2-29,连入另一酵母表达载体pGADT7,并用免疫共沉淀方法再次证实二者间的相互作用。结果:成功克隆出HBV前-S2基因并在酵母细胞中表达,配合后筛选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落26个,其中有1个未知基因S2-29,该基因能在HepG2细胞中表达,免疫共沉淀方法证实二者在体外也有结合作用。结论:成功克隆出与乙型肝炎病毒前-S2蛋白相结合的新基因,为进一步研究HBV前-S2的作用提供了新线索。

应用表达谱芯片技术对乙型肝炎病毒前-S2抗原结合蛋白S2-29反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片技术,研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(preS2)抗原肝细胞结合蛋白基因S2-29 过表达,对HepG2细胞的基因表达的影响. 方法:应用酵母双杂交技术筛选并验证HBV前-S2的肝细胞结合蛋白基因.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增S2-29蛋白编码基因片段,经测序鉴定后构建表达载体pcDNA3.1(-)-S2-29,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-S2-29转染的人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA 进行检测和分析. 结果:筛选出肝文库中HBV前-S2结合蛋白S2-29的编码基因,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有9个基因表达水平显著下调,包括真核翻译延伸因子2、MAP激酶激活的死亡域、谷胱甘肽过氧化物酶、肌动蛋白、NDRG、Prosaposin、SUMO-1激活酶亚基1、胰岛素受体和1个未知功能蛋白.1个未知蛋白编码基因的表达上调. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV前-S2结合蛋白S2—29蛋白的反式调节基因,为进一步阐明S2—29蛋白对细胞表达调控的影响提供了新的依据.

乙型肝炎病毒表面抗原阳性患者前-S1抗原和前-S2抗原与HBV DNA和HBV-M相关性分析

目的检测乙型肝炎病毒患者乙型肝炎病毒前-S1抗原(HBV pre-S1-Ag)、前-S2抗原(HBV pre-S2-Ag)、乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)和乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg),探讨其相关性和临床应用价值。方法应用酶联免疫测定法(ELISA)分别检测HBV pre-S1-Ag、HBV pre-S2-Ag和乙型肝炎病毒标志物(HBV-M),荧光定量聚合酶链反应法(FQ-PCR)检测HBV DNA,并对检测结果进行统计学分析。结果 HBsAg阳性者中,pre-S1-Ag、pre-S2-Ag、HBV DNA阳性者分别为594例、541例、629例,其阳性率分别为66.29%、60.38%、70.20%。HBeAg阳性组pre-S1-Ag、pre-S2-Ag、HBV DNA的阳性率分别为90.21%、74.46%、93.32%,显著高于HBeAg阴性组的45.28%、48.01%、49.89%,差异有统计学意义(P<0.01)。随着HBV DNA载量的增高,pre-S1-Ag、pre-S2-Ag、HBeAg阳性率随之增高。结论 pre-S1-Ag、pre-S2-Ag与HBV DNA和HBeAg阳性检出率具有显著相关性。联合检测pre-S1-Ag、pre-S2-Ag、HBV DNA及HBV-M,有助于HBV早期诊断、疗效观察和预后判断。

肾炎病人肾组织中乙型肝炎病毒前-S_2蛋白的检测及意义

对经肾活检确诊的30例肾炎病人应用单克隆抗体、间接免疫酶标技术检测肾组织中的前-S_2(Pre-S_2)蛋白,同时对肾脏中的HBsAg、HBeAg及血清HBsag、HBeAg、抗HBs、抗HBe、抗HBc进行了观察。结果显示,7/22例原发性肾炎、6/8例狼疮性肾炎病人的肾小球中有Pre-S_2蛋白沉积,分布于毛细血管袢和(或)系膜区,其分布与肾炎类型、肾组织中免疫球蛋白、补体沉积的多少有关。肾脏中Pre-S_2蛋白的沉积与相同部位HBsAg的沉积有联系,与HBeAg的沉积无关。膜性肾病时,Pre-S_2蛋白的沉积与病毒血症有良好的相关性。狼疮性肾炎时Pre-S_2蛋白的沉积很可能是非特异性的。

乙型肝炎及无症状HBsAg携带者血清前-S_2蛋白测定及其临床意义

应用ELISA 夹心法对各临床型乙型肝炎241例和无症状HBsAg 携带者50例的Pre-S_2蛋白进行检测,结果HBsAg 阳性组Pre-S_2检出率95.9%,阴性组全部阴性。HBeAg/抗-HBe 和HBVDNA-P 均与Pre-S_2成正相关关系,提示Pre-S_2的表达与HBV 的复制和感染的相关性。

前-S_2及其联合检测在慢性乙肝诊断中的应用

慢性乙肝的乙肝病毒复制指标（HBV－DNAHBeAg、抗－HBcIgM）的检测方法较多，阳性率各异。文章就本院近年开展的前－S2及其与HBV－DNA、HBeAg、抗－HBcIgM等多指标的联合检测方法，对慢性乙型病毒肝炎住院病人两组53例分析。结果表明，以前－S2阳性率为最高，并在与HBV－DNA、HBeAg、抗－HBcIgM等多指标的联合检测时，可进一步提高阳性率。因此，前－S2及其联合检测是观察HBV复制的灵敏指标和方法。

乙肝病毒前-S_2区的问题探讨

HBV基因由一个小的、环状的,不完整的双股DNA分子组成,其DNA分子上有一个可变长度的单股区。该基因长股携带病毒的全部蛋白编码拷贝,其核苷酸链上有4个编码表面(S)、核心(C)、X蛋白和DNA多聚酶(P)的开放阅读框架(ORFs)。S区是一个单独的,连续性的ORF,

乙型肝炎病毒包膜大蛋白的自激活

目的:构建乙型肝炎病毒包膜大蛋白的酵母表达载体,研究其自激活作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV包膜大蛋白(LHBs),前-S1蛋白(pre-S1),前-S2蛋白(pre-S2)及主蛋白(SHBs)的编码基因,并在其5’端引入EcoRI/BamHI内切酶位点,分别连接入酵母表达载体pGBKT7中,构建酵母表达质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后分别铺于含有X-α-半乳糖的营养缺陷型培养基SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade上进行自激活验证(蓝/白筛选).结果:成功克隆出编码各种HBV包膜蛋白的基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,转化了pGBKT7-LHBs和pGBKT7-preS1的AH109酵母细胞在两种营养缺陷型培养基上均可正常生长,并且可以产生α-半乳糖苷酶从而在铺有X-α-半乳糖的培养基上呈现蓝色,而转化了pGBKT7-preS2和pGBKT7-SHBs的细胞只能在SD/-Trp的培养基上生长,且没有变蓝.结论:LHBs可以作为反式激活子发挥作用,代替GAL4蛋白的激活域来激活GAI4上游激活序列(GALUAS)和TATA盒,从而激活了下游报告基因(ADE2,HIS3,MEL1和LacZ)的表达,并且其自激活作用来自于前-S1结构域.