多氯联苯对剑尾鱼Na^+/K^+-ATPase活性的影响

采用毒性实验的方法,定量地研究了多氯联苯暴露对剑尾鱼肝脏、卵巢及鳃组织中Na^+/K.+-ATPase活性的影响。结果表明:不同组织其Na^+/K^+-ATPase活性的高低存在明显差异。多氯联苯对剑尾鱼肝脏及卵巢的Na^+/K^+-ATPase活性有抑制作用但不显著;对鳃的Na^+/K^+-ATPase活性则显示有显著的抑制作用,并随暴露浓度和时间的增加而提高。3种组织中鳃Na^+/K^+-ATPase对多氯联苯显得更为敏感。

剑尾鱼微卫星DNA的筛选

以剑尾鱼(Xiphophorushelleri)为材料,经MboⅠ限制性内切酶消化基因组DNA后,选取500～2000bp的片段连接到经BamHⅠ酶切的pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5α构建部分基因组文库。采用设计合成的(AC)7、(GT)7重复序列为引物,PCR筛选部分基因组文库,对其中9个重组阳性克隆进行测序,结果共获得24个微卫星序列,其中Perfect(完美型)13个,占54.2%;Imperfect(非完美型)3个,占12.5%;Compound(混合型)8个,占33.3%。表明(AC/GT)n在剑尾鱼的基因组DNA中含量非常丰富。同时,根据其中3个克隆微卫星的侧翼序列设计引物,PCR扩增剑尾鱼基因组DNA,结果均扩增到目的片段。而且,这3对引物扩增出来的微卫星片段在非选育的剑尾鱼中显示出多态性,而在近交系19代则表现为单态,为剑尾鱼的实验动物化遗传研究提供了理论依据。

剑尾鱼在检测细菌毒力方面的应用

用 18株从鱼类所分离的细菌攻毒剑尾鱼 ,结果显示细菌对剑尾鱼的毒力与回归感染或攻毒敏感鱼的毒力结果较为一致 ,另外 ,用剑尾鱼感染病原菌的适宜途径为背肌注射 ,与原代比较 ,近交高代剑尾鱼个体之间对病原菌的反应较为一致 ,感染后死亡时间相对集中。

剑尾鱼感染嗜水气单胞菌的动态病理变化观察

对剑尾鱼感染嗜水气单胞菌的病理变化进行了全面细致的观察。结果显示 :剑尾鱼感染发病呈急性过程 ,感染后 10～ 15h为发病死亡高峰期 ;病理组织学变化以全身溶血性贫血和广泛的组织细胞变性、坏死为主 ;感染发病死亡时间主要集中在 5～ 2 4h ,感染部位和鳃最先受到损伤 ,最终因各器官结构破坏、功能衰竭和窒息而亡。

剑尾鱼卵黄蛋白原的ELISA检测

以卵黄脂磷蛋白（lipovitellin,Lv）抗血清为抗体,以纯化的卵黄蛋白原（vitellogenin,Vtg）为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应（ELISA）方法检测剑尾鱼（Xiphophorus helleri）雄鱼整体匀浆液中ρ（Vtg）.结果表明,该方法的检测灵敏度为7.8 ng/mL,批内变异系数为5.094%,批间变异系数为5.540%,工作范围为32.5～2 000 ng/mL,在该范围内,标准曲线具有良好的线性和重复性.由于该方法可直接在1块或在不同的酶标板上准确地进行比较,因而可利用ELISA方法测定经诱导雄鱼整体匀浆液中ρ（Vtg）水平.结果显示,50μg/L 17-β雌二醇（E2）诱导21 d的雄性剑尾鱼有明显的Vtg产生;10μg/L E2诱导剑尾鱼亦有Vtg产生,但较50μg/L E2诱导组低;1μg/L E2诱导组及对照组剑尾鱼没有Vtg产生,检测孔OD450/对照OD450（P/N）值小于2.1.

剑尾鱼RW-H近交系的遗传结构分析

筛选31条随机引物对剑尾鱼的第8代近交RW-H系A、B、C 3窝共11尾剑尾鱼个体基因组DNA进行RAPD扩增,计算近交系个体间及不同窝间的相似系数及遗传距离。结果筛选的31条引物共扩增出383条带,扩增片段的大小在0.2～3kb。其中多态性带30条,多态性带频率在0～58.33％,平均为7.83％。近交系剑尾鱼不同个体拥有相同条带的比率较高。计算得到近交系的平均相似系数(S)为0.9829(0.9716～0.9960),平均等位基因频率(?)为0.8692,最低平均杂合率(?)为0.1308。同时,用5个微卫星标记对非选育剑尾鱼和近交系RW-H系的基因组进行分析,检测等位基因的个数和大小,结果5个微卫星座位在非选育剑尾鱼中显示为多态,而在近交系RW-H系除1个位点出现等位基因外,其余均为纯合子,计算得到近交系的平均遗传相似系数为0.9345,两种方法均证明近交RW-H系第8代剑尾鱼有较高的遗传纯合度。

抗生素药物环丙沙星对剑尾鱼的毒性效应

测试了抗生素药物盐酸环丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride,CPFX)对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的急性毒性及其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶活性的影响。结果表明CPFX对剑尾鱼无急性毒性;CPFX对剑尾鱼肝脏还原型谷光苷肽(GSH)、谷光苷肽硫转酶(GST)和7-乙氧基异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)都存在诱导作用;雌雄个体在EROD的诱导响应有一定的差异性,其中雌性个体EROD对CPFX暴露响应变化较大。

汞和硒对剑尾鱼Na^+/K^+-ATPase活性的影响

应用浸浴法研究汞(Hg)对剑尾鱼(XiphophorushelleriHeckel)鳃和肝脏Na+/K+ATPase活性的影响以及硒(Se)对机体Na+/K+ATPase汞中毒的保护作用.结果表明,Hg和Se对剑尾鱼96hLC50分别为0.84mg/L和6.64mg/L.Hg对剑尾鱼鳃和肝脏Na+/K+ATPase活性的影响相似,与对照组相比,处理d1时低浓度Hg组鳃和肝脏ATPase活性没有明显变化(P>0.05),但高浓度Hg组ATPase活性变化显著(P<0.05),至d3和d5时,酶活性均极显著下降(P<0.01),鱼鳃和肝脏酶活性分别下降32%和60%,表明Hg处理对鳃和肝脏Na+/K+ATPase活性具有抑制作用.单独加Se组鱼鳃和肝脏Na+/K+ATPase活性在d3和d5显著提高(P<0.01).Hg+Se组与Hg组相比,酶活性有明显差异(P<0.05或P<0.01),Se对剑尾鱼Hg中毒具有保护作用.剑尾鱼鳃和肝细胞Na+/K+ATPase活性可作为对水环境汞污染效应环境风险评价(ERA)的有效生物学标记.

剑尾鱼鳃结构的光镜、扫描和透射电镜观察

应用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜对剑尾鱼(Xiphophorushelleri)鳃的组织结构、表面形态特征及鳃小片超微结构进行了观察。结果表明鳃耙既有呈长锥状又有呈膜质状的结构;鳃丝末端膨大呈杓状;鳃小片呈褶皱状,镶嵌排列在鳃丝两侧。鳃弓及鳃耙内表面分布众多味蕾。鳃丝呼吸面上皮细胞薄,高度血管化,形成呼吸面隆起;非呼吸面由具微嵴的上皮细胞彼此相连,胞间具分泌细胞开口。鳃小片由单层或数层上皮细胞和由基膜相隔的柱状细胞及其围在血管腔的凸缘构成,氯细胞多分布在鳃小片基部,并有开口通外。本文还讨论了剑尾鱼鳃结构与其功能的密切关系。

多氯联苯对剑尾鱼超氧化物岐化酶活性的影响

目的 研究多氯联苯 (PCBs)暴露对剑尾鱼 (Xiphophorushelleri)超氧化物歧化酶 (SOD)活性的影响 ,探讨剑尾鱼器官组织内SOD活性变化作为环境风险评价 (ERA)的有效生物学标记的可行性。方法 测定了PCBs对剑尾鱼 30d的半致死浓度 (LC50 ) ;使用浸浴法以 0、2、5 0 μg L三个PCBs浓度为剑尾鱼染毒 ,定量测定了 72h内肝、鳃及卵巢组织中的SOD的活性变化。结果 PCBs对剑尾鱼的 30dLC50 为 1 0 5 80 μg L ;PCBs对剑尾鱼肝脏和卵巢的SOD活性有明显 (P <0 0 1 )的影响。在最初染毒的 1 2h内 ,SOD活性略有上升 ,但随暴露时间延长 ,浓度增加 ,肝和卵巢的SOD活性均呈下降趋势。此外 ,结果还显示肝组织的SOD活性较高于卵巢的SOD活性 ,表明不同器官组织的SOD活性对PCBs胁迫的敏感性存在一定的差异。实验中鳃组织SOD活性在PCBs暴露后其变化不明显 (P >0 0 5 )。结论 表明剑尾鱼肝细胞SOD活性可作为环境风险评价 (ERA)

剑尾鱼卵黄脂磷蛋白的纯化及免疫分析

采用Sephacryl S-300凝胶过滤层析柱和HiTrap Q阴离子交换柱从卵黄生成期的雌性剑尾鱼（Xiphophorus helleri）卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白（Lv）。已确定被纯化的剑尾鱼Lv在Native-PAGE（4％～7．5％）电泳中分子量为530kD左右。Native-PAGE（4％～7．5％）电泳后的凝胶分别进行糖蛋白染色、脂蛋白染色及磷蛋白染色。结果表明，剑尾鱼Lv是一种富含糖、脂、磷的蛋白。用纯化的剑尾鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清。用免疫双扩散的方法测定Lv抗血清的效价为1：32。Western-blotting检测显示抗血清的特异性较好；卵黄蛋白原（Vtg）和Lv抗血清之间存在明显的免疫交叉反应，表明Vtg和Lv两者具有相同的免疫原性。免疫双扩散检测表明，抗Lv血清表现出明显的雌性特异性和种的特异性。

剑尾鱼RW-H近交系20个微卫星位点的遗传结构

为了对水生实验动物剑尾鱼（Xiphophorus helleri）RW-H系近交15代的遗传结构进行研究，寻找该近交系的标志基因位点，选择20个在野生剑尾鱼群体具多态性的微卫星位点，对剑尾鱼RW-H系（红眼白体）30尾个体进行分析。结果表明，其中有17个位点为单态，有可能作为该近交系的标志基因位点；另外3个位点Msa012、Msa033和Msc036具有多态性，多态信息含量值分别为0．3047、0．3457和0．3648。通过Pop-gene3．2软件分析得知全部基因位点的纯合率达到了95．83％，个体间平均遗传距离为0．0482（0．0000～0．1625），遗传相似系数为0．9518（0．8500～1．0000），说明剑尾鱼RW-H系已经具有很高的近交程度。几个多态性位点的发现，可以指导近交选育，加快选育进度。本研究方法不仅检测出剑尾鱼RW-H系具较低的遗传多样性，而且可为中国建立分子水平的实验动物监测标准提供基础数据。[中国水产科学，2007，14（4）：602—607]

热应激对剑尾鱼HSP70家族两成员基因表达的影响

采用RT-PCR方法扩增实验动物剑尾鱼（Xiphopohorus helleri）纯系RR-B的HSP70家族两个成员的eDNA片段，并将其克隆到PMD18-T载体中测序，将测序结果与GenBank中的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较。同时利用RT-PCR半定量方法研究热应激时两个成员在剑尾鱼组织中的表达。通过克隆获得了剑尾鱼的HSP70家族两个新成员的cDNA片段，两序列均包含HSP70家族的特征性签名序列和热休克蛋白的定位序列；通过对克隆片段与已发表的青锵（Oryzias latipes）等鱼类HSP70的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列同源性比较，发现核苷酸序列同源性较高，成员一和成员二分别为85％-89％和82％-99％；氨基酸序列同源性更高，成员一和成员二分别为97％-99％和93％-99％。一般条件下，两成员在剑尾鱼肝脏、脾脏、肾脏和心脏中不表达，但热应激能刺激成员一在剑尾鱼脾脏中表达，成员二在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中强烈表达，并可能在参与热应激保护方面起更大作用。

17β-雌二醇对剑尾鱼卵黄蛋白原的诱导研究

目的 研究17p雌二醇（E2）暴露对雄性剑尾鱼（Xiphophorus helleri）卵黄蛋白原（vitellogenin，Vtg）诱导作用作为环境风险评价（ERA）的有效生物学标记的可行性。方法 以E2诱导的剑尾鱼雄性个体的整体匀浆液为材料，采用Sephaeryl S-300凝胶过滤层析柱和Q Sepharose阴离子交换柱从剑尾鱼体内提纯Vtg。结果确定了被纯化的剑尾鱼Vtg在4%-7．5%Native PAGE电泳中相对分子质量为540×l0^3 . 4%-7．5%Native PAGE电泳后的凝胶分别利用苏丹黑B进行脂蛋白染色、高碘酸．Schiff试剂进行糖蛋白染色和甲基绿进行磷蛋白染色，表明剑尾鱼Vtg是一种富含糖、脂、磷的蛋白。结论表明雄性剑尾鱼卵黄蛋白原的诱导变化可作为环境风险评价（ERA）的有效生物学标记。

红火蚁专性药剂红蚁净对剑尾鱼的急性毒性试验

以剑尾鱼Xiphophorus helleri为试验对象,初步研究了不同浓度的红蚁净(pyragne)对剑尾鱼的急性毒性。结果显示:LC50,24 h=974.99 mg/L,LC50,48 h=606.74 mg/L,LC50,72 h=542.00 mg/L。按《化学农药安全评价试验准则》评价:红蚁净为低毒药剂。预测其安全浓度为70.50 mg/L。在实际应用中,进入水体中的药剂浓度远远低于安全浓度,所以在池塘或其他养殖等非饮用水体边缘使用红蚁净,只要按药剂使用浓度和方法进行,对鱼类是安全的。

三氯异氰尿酸对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)毒性及其抗氧化酶影响

采用生物毒性测试与评价方法对常用消毒剂药物三氯异氰尿酸(Trichloroisocyanuric acid,TCCA)对剑尾鱼的急性毒性及其Ⅰ、Ⅱ相代谢酶活性影响进行了研究。结果表明,TCCA对剑尾鱼的96h LC50为2.15mg/L。TCCA对剑尾鱼肝脏还原型谷光苷肽(GSH)、谷胱苷肽硫转酶(GST)和7-乙氧基异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)都存在诱导作用。雌雄个体在GST和EROD的诱导响应时间有显著差异性,其中雄性个体GST对TCCA暴露响应比雌性个体敏感。

溶藻弧菌感染对剑尾鱼HSP70基因表达的影响

用溶藻弧菌Vibrio alginolyticus感染剑尾鱼Xiphophorus helleri,取感染后第0、2、5、8、11 d的活鱼及感染后第2 d濒死鱼,采用半定量RT-PCR方法分别检测HSP70基因在肝胰脏、脾脏、头肾和心脏组织中的表达。结果表明:正常条件下,HSP70在检测的剑尾鱼组织中均不表达;在用溶藻弧菌感染第8 d的剑尾鱼肝胰脏内,HSP70基因被诱导强烈表达,HSP70/β-actin的值为1.80±0.03;在感染第2、5 d的剑尾鱼头肾内,HSP70基因被诱导表达,第8 d HSP70基因强烈表达,感染濒死鱼头肾内也检测到HSP70基因的强烈表达,HSP70/β-actin的值分别为0.35±0.02、0.15±0.01、2.00±0.06和0.95±0.05;在剑尾鱼被感染第2、5、8 d,在脾脏内均检测到HSP70基因的表达,感染濒死鱼脾脏内也检测到HSP70基因的强烈表达,HSP70/β-actin的值分别为0.30±0.02、0.15±0.01、0.45±0.03和1.55±0.04;仅在感染濒死鱼的心脏中检测到HSP70基因的表达,HSP70/β-actin的值为0.30±0.02;到第11 d HSP70基因表达消失。

剑尾鱼线粒体细胞色素b基因的序列分析

目的 克隆和测定剑尾鱼 (Xiphophorushelleri)线粒体细胞色素b基因 (cytb)的全序列。方法 提取剑尾鱼肝脏的总DNA。设计合成特异引物进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳检测、纯化后克隆到pGEM Teasyvectorsystem中的T载体上 ,筛选转化子 ,提取质粒 ,酶切鉴定。挑取重组质粒pGEM T xhcytb 11进行序列测定。结果 获得了剑尾鱼线粒体cytb基因的全序列 ,共 114 0bp。结论 用BLAST与GenBank中的线粒体DNA序列进行比较 ,显示剑尾鱼与其他鱼类的cytb基因具有较高的同源性 ;根据剑尾鱼与其他 13种鱼的cytb基因序列同源性所建立的进化树 。