肾透明细胞癌转移相关的CD99选择性剪接异构体的筛选

目的:寻找人肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中CD99转移相关选择性剪接异构体,探讨CD99选择性剪接异构体表达与ccRCC转移的关系。方法:通过选择性剪接数据库(alternative splicing database,ASD)对CD99基因可能存在的选择性剪接异构体进行预测。运用自行设计的5对特异性引物,采用RT-PCR技术,在转移组织、发生及未发生转移的癌组织、癌旁组织的各混合样本中检测6种预测异构体的表达,再对电泳所获条带进行克隆、测序。在各个组织样本中检测CD99Ⅰ、CD99Ⅱ和新型CD99选择性剪接异构体(CD99-Ⅲ)的表达。结果:从6种预测异构体中筛选出一种新型异构体(CD99-Ⅲ)。该异构体在转移组织中表达率(8/9)高于未发生转移的原发癌组织(10/21,P<0.05)。CD99Ⅰ型在样本中均表达,CD99Ⅱ型在发生转移的原位癌组织中表达率(6/9)远高于未转移的原发癌组织(3/21,P=0.008)。结论:CD99-Ⅲ为一种新型选择性剪接异构体,且CD99Ⅱ型、CD99-Ⅲ的表达可能与ccRCC的转移进展有关。

1个新的白介素-32剪接异构体的克隆与表达

目的对白介素-32(interleukin-32,IL-32)的不同剪接异构体进行克隆及表达。方法设计保守引物,以Jurkat细胞的cDNA为模板进行PCR扩增,克隆IL-32不同剪接异构体;DNA测序扩增产物,计算机辅助分析IL-32基因序列特征;构建IL-32原核及真核表达重组质粒,并利用SDS-PAGE和Western blot检测其表达情况。结果克隆得到已知的IL-32的6个剪接异构体(α、β、γ、δ、ε、ζ),还克隆得到1个新的IL-32剪接异构体,将其命名为IL-32η,Genbank登录号JN546102。IL-32η编码区长度为336 bp,编码的蛋白含111个氨基酸残基,其理论相对分子质量为12 560。IL-32η原核表达产物主要以可溶形式位于宿主菌的周质腔。亲和纯化了重组IL-32η,利用重组IL-32η制备了兔多克隆抗体,该抗体能够识别IL-32全部的7个剪接异构体。结论克隆得到1个新的IL-32剪接异构体IL-32η,它的发现将为全面理解IL-32的功能提供新思路。

人结肠癌组织环加氧酶-2 mRNA剪接异构体片段分离与克隆

目的 探讨人结肠癌组织中是否存在环加氧酶 2 (COX 2 )选择性剪接异构体的表达及其可能意义。方法针对人COX 2DNA第 7、 8外显子序列 ,设计一对全新引物 ,并采用RT PCR技术 ,从结肠癌组织中分离COX 2mRNA ,然后对电泳条带进行克隆、测序和分析。结果 正常结肠组织和结肠癌组织均发现COX 2目的条带 ( 2 5 2bp) ,但结肠癌组织则出现了一条新的电泳带 ( 5 34bp) ,经克隆和测序证实 ,该条带除目的条带的COX 2DNA的第7、 8外显子序列外 ,还包含第 7、 8外显子间的内含子序列 ,即保留的内含子 ( 2 82bp)。根据阅读框推测 ,在保留的内含子第 4 8～ 5 0碱基出现终止密码。结论 首次发现结肠癌组织中存在COX 2基因的选择性剪接异构体 (Genbankaccessionnumber:BU4 936 0 2 ,AY15 12 980 ) ,其所编码蛋白可能较已报道的COX 2酶蛋白小 ,且蛋白质的C末端缺少阿斯匹林作用位点。

全反式维甲酸诱导神经母细胞瘤分化及TrkA剪接异构体表达的研究

目的:通过对NB细胞系SH-SY5Y进行体外实验,研究ATRA对NB细胞的增殖抑制与诱导分化作用,进而探讨TrkA剪接异构体在不同分化程度的SH-SY5Y细胞中的表达情况。方法:将SH-SY5Y细胞取对数生长期细胞培养分组,利用台盼蓝拒染计数活细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测TrkA三种剪接异构体的表达水平。结果:对照组活细胞数随着培养时间延长而增多,实验组中ATRA对SH-SY5Y的生长抑制作用在(0.1-10)μmol/L浓度范围内有剂量依赖关系。不同浓度的ATRA均可诱导SH-SY5Y细胞产生形态学上的变化,对照组细胞分化百分率随时间延长无明显变化,各时间段间比较,差异不显著(F=2.889,P=0.079)。TrkAⅠ/ⅡmRNA表达水平增加与ATRA浓度及作用时间呈正相关。TrkAⅢmRNA表达与ATRA浓度及作用时间呈负相关。结论:在SH-SY5Y细胞中,ATRA对细胞生长抑制作用呈明显的时间和剂量依赖关系;TrkAⅠ/Ⅱ表达与ATRA作用时间、剂量呈正相关;随着ATRA作用浓度及作用时间的增加,TrkAⅢmRNA表达降低。

顺铂处理癌细胞后CDC25 mRNA剪接异构体的变化

目的:探讨顺铂(CDDP)对肺癌、宫颈癌细胞和人胚肾细胞CDC25磷酸酶mRNA的选择性剪接的影响。方法:将培养的肺癌A549和H1299细胞,宫颈癌C33A、SiHa、CaSki细胞及人胚肾293FT细胞分为实验组和对照组,实验组细胞用CDDP处理,对照组细胞用DMSO处理,设计CDC25A、CDC25B、CDC25C引物,利用RTPCR检测CDC25 mRNA剪接异构体的表达变化。结果:与对照组细胞比较,随着CDDP浓度的增加,肺癌A549和H1299细胞,宫颈癌C33A、SiHa和CaSki细胞以及人胚肾293FT细胞中CDC25B、CDC25C mRNA剪接异构体比例有明显变化,而CDC25A mRNA剪接异构体变化不明显。结论:CDDP引起细胞DNA损伤时,可发生CDC25mRNA选择性剪接异构体的比例发生变化,这可能与肿瘤药物治疗时的抗性有关。

NR4A2基因及其选择性剪接异构体与胃癌发生及转移的关系

目的:检测胃癌中NR4A2(又称Nurr1)基因的表达,从NR4A2调控机制出发寻找相关选择性剪接异构体,探讨其与胃癌发生和转移的关系。方法:通过选择性剪接数据库(ASD)预测NR4A2基因可能存在的选择性剪接异构体,半定量PCR检测NR4A2及异构体的表达,基因测序技术鉴定新的剪接异构体;实时定量PCR检测41例样本中NR4A2及剪接异构体的表达水平;免疫组织化学方法检测28例样本中NR4A2蛋白表达。结果:NR4A2基因在胃癌原位、癌旁、转移组织中均有表达,确定了2种剪接异构体NR4A2-Ⅰ和NR4A2-Ⅱ。实时定量PCR检测41例样本中NR4A2及2种异构体在癌旁组织表达水平高于原位癌(P=0.017,P=0.007,P=0.004);在肝转移灶中表达水平低于原位癌(P=0.001,P=0.018,P=0.016),差异有统计学意义。免疫组化检测发现癌旁组织中NR4A2表达阳性率高于原位癌及转移灶,但差异无统计学意义(P=0.672)。结论:胃癌原位、癌旁和转移组织中至少存在NR4A2基因的2种剪接模式;NR4A2及异构体的表达变化与胃癌发生和转移相关。

TCF4N剪接异构体在食管癌细胞中的表达研究

目的证实食管癌中TCF4N剪接异构体的存在,并初步探讨其功能。方法采用RT-PCR方法扩增,并PCR产物测序鉴定。克隆TCF4N剪接异构体并构建真核表达载体,将其转染EC109细胞高效表达,检测其对细胞生物学特性的影响。结果在癌细胞株中,TCF4N剪接异构体被证实存在。对比食管癌组织与癌旁组织发现TCF4N异构体在癌组织中表达显著降低(P<0.05)。成功构建了TCF4N表达载体,在EC109细胞中获得高效表达。功能分析显示:增强TCF4N表达可抑制EC109细胞的增殖,影响细胞周期的分布,并抑制TCF4的转录活性。结论在人食管癌中具有抑制功能的TCF4N剪接异构体与食管癌的发生有一定关联。

人M961全长cDNA及剪接异构体的分离与克隆

目的分离、克隆人M96基因,并初步探索其在不同血细胞系中的表达。方法根据与鼠M96基因有较高同源性的人表达序列标签(EST)设计筛库引物,筛选成人睾丸及胎脑cDNA文库,采用BLAST及CLUSTALW等程序比较分析筛选到的阳性克隆;应用多细胞系杂交膜分析该基因在各细胞系的表达;用氯化血红素诱导K562细胞向红系分化,探讨该基因在此过程中的表达变化。结果从文库中筛出长度分别为1878和1382bp的M96cDNA克隆,二者为剪接异构体,其开放阅读框分别编码491及262个氨基酸,分别命名为M961和M962(GenBank接受号分别为AF072814和AF073293)。Northern杂交结果表明,在所检测的10种血细胞系中,人淋巴细胞白血病细胞系CEM的M961基因表达量最高,在有巨核及红系特点的Hel、Dami及K562白血病细胞系中M961的表达量也较高。在K562细胞分化过程中,M961基因表达略有升高。结论M961基因在某些白血病细胞系中表达量较高。

大鼠巨噬细胞环加氧酶-2剪接异构体MRNA片段的分离和鉴定

目的:分离和鉴定大鼠巨噬细胞环加氧酶-2剪接异构体MRNA片段,并分析其可能意义。方法: 采用RT-PCR和测序分析从大鼠巨噬细胞扩增、分离环加氧酶-2剪接异构体CDNA片段,并推导环加氧酶-2剪接异构体氨基酸序列,利用生物信息软件对氨基酸序列进行分析。结果:大鼠肺和血管平滑肌组织及腹腔巨噬细胞均发现COX-2目的条带(253 BP),但腹腔巨噬细胞则出现了一条新的电泳带(422 BP),经克隆和测序证实,该条带除目的条带的COX-2 DNA的第7、8外显子序列外,还包含第7、8外显子间的内含子序列,即保留的内含子(169 BP)。根据阅读框推测,在保留的内含子第21-23碱基出现终止密码。结论:首次发现大鼠腹腔巨噬细胞中存在 COX-2基因的选择性剪接异构体(GENBANK ACCESSION NUMBER:BU500100),其生物学意义有待进一步研究。

比格犬雌激素受体β四个剪接异构体的发现

目的在比格犬下丘脑-垂体-性腺轴上筛查雌激素受体β的剪接异构体。方法针对ERβmRNA CDS序列的八个外显子,两两外显子依次组合设计引物,运用PCR法,以比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织c DNA为模板扩增相应序列,测序后在NCBI网站比对,确定是目的基因后,用DNAMAN软件比对分析及手工校对,获得ERβ的剪接异构体。结果获得到了比格犬ERβ的四个剪接异构体,分别是第4外显子完整缺失的ERβ剪接异构体(缺失300 bp),部分第4与部分第5外显子组合缺失的两个组合型缺失的ERβ剪接异构体(各缺失334bp,265 bp),以及第七外显子完整缺失的ERβ剪接异构体(缺失181 bp)。第4外显子完整缺失的剪接异构体和第7外显子完整缺失的剪接异构体获得了全长编码序列,另两个剪接异构体为部分编码序列。结论研究获得了比格犬ERβ的四个剪接异构体,为后续研究其在比格犬生殖调控中的作用机制打下了基础。

FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

目的观察FoxMl剪接异构体在女性上皮性卵巢癌中的表达特征，并探讨其应用价值。方法恶性组50例，为经手术治疗及术中获取病灶组织病理检测确诊的上皮性卵巢癌患者；良性组50例，为影像学及病理诊断为卵巢良性肿瘤者；正常组50例，为其他妇科疾病入院但经临床症状、影像学检查等未见卵巢异常者。均取卵巢病理组织切片免疫组化染色，免疫荧光法检测FoxM1表达阳性情况。结果恶性、良性和正常组卵巢组织FoxM1的表达阳性率比较差异有统计学意义（x2=21．141，P〈0．001），两两比较，恶性组显著高于良性组及正常组（x2=16．284、5．363，P〈0．01），良性组显著高于正常组（X2=10．187，P〈0．01）；统计结果显示FoxM1阳性表达与上皮性卵巢癌FIGO分期、分化程度以及淋巴结转移密切相关，差异有统计学意义（P〈0．05或〈0．01）；经单因素、多因素分析显示，只有FIGO分期、淋巴结转移可作为上皮性卵巢癌患者的独立预后因素。结论FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中呈现为高表达，且与上皮性卵巢癌FIGO分期、分化程度、病理分型以及淋巴结转移密切相关；经分析，上皮性卵巢癌患者的独立预后因素为FIGO分期、淋巴结转移和FoxM1表达阳性。

Nek2剪接异构体及其与肿瘤关系的研究进展

Nek（NIMA-related kinase,Nek）激酶为哺乳动物细胞中的NIMA相关激酶。NIMA最初是在曲霉中被发现的,其对细胞周期突变体nimA进入有丝分裂起重要作用,过表达的NIMA甚至能使处于细胞周期中任意时刻的细胞进入有丝分裂。与NIMA相似，Nek在细胞周期调控中，尤其是中心体周期调控方面起重要作用。1992年Letwin从小鼠体内分离得到第1个与NIMA相关的基因Nek1，开启了哺乳动物Nek蛋白研究的大门。

猪FcγR ⅡB多种剪接异构体的基因克隆与序列分析

目的:研究猪FcγRⅡB受体基因选择性剪接的多样性。方法:根据GenBank中猪FcγRⅡB(swFcγRⅡB)cDNA基因序列(DQ026064),应用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,应用RT-PCR技术,从不同个体的猪肺泡巨噬细胞中扩增FcγRⅡB基因并进行测序分析,在GenBank中查找猪FcγRⅡBDNA序列(NW-001886241.1),并用相关软件分析其外显子组成。结果:共克隆出6个转录体,其中转录体2,4在信号肽部分都有一个丙氨酸的缺失。转录体5,6是两个新型的FcγRⅡB转录体,转录体5胞外区只有一个Ig结构域,转录体6是一个只含有一个Ig结构域的推导性可溶性Fc受体。结论:猪FcγRⅡB的表达因RNA选择性剪接方式不同而呈现出多样性。

反义寡核苷酸处理伊马替尼耐药慢粒细胞后Bcl-x剪接异构体的变化

目的探讨反义寡核苷酸Vivo-Morpholinos(vMO)处理对伊马替尼(Imatinib,IM)耐药慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞中Bcl-x基因选择性剪接的影响。方法将IM(1μM)组、荧光标记的vMO、IM联合vMO组(IM+vMO)、空白对照组分别与IM耐药CML细胞株K562/G01细胞进行共培养48h,通过RT-PCR和Western Blot分别检测K562/G01细胞胞内Bcl-x剪接异构体Bcl-xL/Bcl-xS mRNA和蛋白比值变化。结果分别与IM组和vMO组处理K562/G01细胞相比,IM+vMO组的Bcl-xL mRNA和蛋白表达量显著降低,同时Bcl-xS mRNA和蛋白表达量明显升高,而对照组中Bcl-x剪接异构体变化不明显。结论 K562/G01细胞在vMO处理后Bcl-xL/Bcl-xS mRNA和蛋白比值显著下调。

ORMDL3剪接异构体的鉴定及在反复喘息患儿中的表达水平分析

目的对反复喘息儿童外周血中血清类粘蛋白1样蛋白3(ORMDL3)的剪接异构体ORMDL3-v1进行鉴定并对其表达水平进行分析。方法反复喘息儿童外周血提取RNA,根据ORMDL3-v1的mRNA序列,设计引物行5′-RACE实验,鉴定其是否存在。随后选择48名患有反复喘息的5岁以下儿童,分为喘息A组28例和喘息B组20例;正常对照组选取的是32例正常体检的儿童,检测外周血ORMDL3-v1及其野生型ORMDL3基因的表达水平。同时计算ORMDL3-v1/ORMDL3的比值,并分析各组病例的临床特点。结果5′-RACE实验证实反复喘息儿童外周血中存在ORMDL3-v1的表达。正常对照组ORMDL3-v1及ORMDL3基因表达水平都显著低于喘息A组和B组(P<0.01),喘息B组ORMDL3的表达水平显著低于A组(P<0.01),喘息A组和B组ORMDL3-v1的表达水平在统计学上差异不明显(P>0.05)。喘息A组ORMDL3-v1/ORMDL3的比值与喘息B组无差异(P>0.05),二者均低于正常对照组(P<0.01)。结论ORMDL3-v1及ORMDL3的表达水平与5岁以下儿童的反复喘息密切相关。

T细胞因子-4及其剪接异构体与肿瘤

T细胞因子(TCF-4)是W nt信号转导通路中的核内信号分子,胞质区的β-连接素入核与之结合,可激活W nt转导通路靶基因的转录,影响一系列基因的表达,在多种胚胎的发育及肿瘤演进的过程中,起重要的作用。TCF-4在转录过程中发生选择性剪接,形成多种mRNA剪接异构体,其剪接主要发生在羧基末端,形成长短不等的开放阅读框架,进而对下游基因产生多种转录调节机制,并对W nt信号在各系统肿瘤中的作用进行调控。TCF-4及其剪接异构体的过度表达和异常调控与肿瘤的发生发展密切相关。

猫疱疹病毒Ⅰ型US3基因剪接异构体的鉴定

为鉴定猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3基因的编码产物,本研究以提取FHV-1感染细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增US3基因转录产物,测序结果显示除了全长US3基因(1 056 bp)外,还出现了一个825 bp的片段(US3-X1)。该片段是由全长US3基因在226 bp^458 bp位置发生了自我剪接,导致234 bp DNA缺失而产生,但ORF并没有改变。此外,通过重叠延伸PCR将US3基因226 bp处碱基"A"突变为"G"(m US3),改变自我剪接位点。将全长US3基因、m US3和US3-X1基因分别克隆至p3×Flag-CMV-10中,转染F81细胞,经western blot检测表明FHV-1 US3可以表达两种不同分子量的异构蛋白,大小约为45 ku和50 ku。这种US3基因的剪接异构体现象在猪伪狂犬病毒和人单纯疱疹病毒中已有报道,而FHV-1 US3基因的剪接异构体的鉴定尚属首次。该研究结果为进一步研究FHV-1 US3异构体蛋白的功能奠定了基础。

干扰素调节因子新剪接异构体IRF7-e的结构及功能

干扰素调节因子7是诱导Ⅰ型干扰素表达的最主要的转录因子。寻找IRF7新的剪接异构体,研究其结构及功能,为探索IRF7参与调控Ⅰ型干扰素机制的多样性提供基础。通过PCR和Sanger测序获得了IRF7一种新的剪接形式IRF7-e,并通过RACE获取了IRF7-e基因全长。IRF7-e全长为1994bp,含5'-UTR 410bp,3'-UTR 120bp,开放阅读框1464bp,编码487个氨基酸的蛋白,预测其等电点为6.659,蛋白分子量为52.8kD。双荧光素酶报告分析表明过表达IRF7-e能够提高Ⅰ型干扰素IFNα和IFNβ启动子的活性,其中对IFNα启动子活性提高了12.18倍,对IFNβ的启动子活性提高了2.99倍。表明IRF7-e可能参与Ⅰ型干扰素的调控。

绵羊IGF-Ⅰ基因剪接异构体克隆及生物信息学分析

胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor I,IGF-Ⅰ)是机体重要的生长因子,可作为培育高产、优质的毛用、肉用家畜新品种时重要的候选基因,但其在转录过程中存在着选择性剪接现象。本研究成功克隆得到了绵羊IGF-Ⅰ基因Ⅰ类Ea型和Eb型两种剪接异构体,并结合生物信息学方法对其结构与功能进行分析。研究结果表明,克隆得到的绵羊IGF-Ⅰ基因Ⅰ类Ea型与GenBank数据库信息相一致,预测编码154个氨基酸;IGF-Ⅰ基因Ⅰ类Eb型为新发现的剪接异构体,预测编码188个氨基酸。信号肽分析显示两剪接异构体均在49~50位氨基酸处存在潜在的信号肽切割位点;系统进化树分析显示两种剪接异构体在进化上均与哺乳动物更为接近,与灵长类、啮齿类和两栖类较远;蛋白理化性质分析显示,两剪接异构体在等电点及亲疏水性上存在部分差异,但总体上表明疏水性较弱,亲水性较强,为亲水性氨基酸;亚细胞定位结果表明二者均为分泌型蛋白质,主要存在于分泌途径;两剪接异构体均存在两个跨膜螺旋,但不存在明显的跨膜区,不是跨膜蛋白,二者含有不同数量的糖基化位点和磷酸化位点;蛋白质二级结构分析显示两剪接异构体均以α-螺旋为主,蛋白质三级结构分析显示为明显的弯曲状螺旋结构。

顺铂处理的肺癌细胞NSUN 2 mRNA剪接异构体变化

目的:探讨顺铂(CDDP)处理肺癌细胞后NSUN 2 pre-mRNA的剪接变化。方法:在NSUN 2基因的pre-mRNA有选择性剪接的外显子两侧的外显子上设计检测引物,选取16例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织及其癌旁正常组织,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测组织NSUN 2各mRNA剪接异构体的表达;取人肺癌细胞系A549细胞和H1299细胞分别用不同浓度CDDP处理,A549细胞分为0、8、16、24、32、40、48及56μmol/L组,H1299细胞分为0、12、24、36、48、60、72及84μmol/L组,采用RT-PCR检测各组细胞NSUN 2各mRNA剪接异构体的表达;RT-PCR产物胶回收后进行TA克隆测序并与NCBI网站数据库中NSUN 2的序列进行比对分析。结果:人肺癌细胞系A549细胞和H1299细胞及肺癌临床样本中NSUN 2基因可编码蛋白的mRNA剪接异构体表达量最高,占主导地位;随着CDDP浓度增加,NSUN 2可编码蛋白的异构体在H1299细胞的高浓度组中的表达下降(P<0.01),非编码蛋白的异构体在A549细胞和H1299细胞的高浓度组中表达均上升(P<0.05);检测到2种未见报道的mRNA剪接异构体。结论:CDDP处理后肺癌细胞中NSUN 2 pre-mRNA剪接会发生变化,NSUN 2基因的表达存在pre-mRNA选择性剪接调控。