SPF大白猪和长白猪CIITA基因剪接突变体的鉴定分析及在不同组织中的表达模式

为了鉴定分析SPF大白猪和长白猪CIITA剪接突变体,研究其在猪不同组织中的表达模式。本研究以5周龄的8头SPF大白猪和7头SPF长白猪为研究对象,设计特异性引物对CIITA基因进行扩增、克隆和测序,对获得的序列分析其剪接突变体特征,利用在线软件对不同剪接突变体进行生物信息学分析,同时利用荧光定量PCR方法检测CIITA基因剪接突变体在2头SPF长白猪8种组织中的表达模式。结果显示,在SPF大白猪和长白猪CIITA基因CDS区存在3种不同的剪接突变体(CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C),其CDS长分别为939、984和1698 bp。CIITA-A和CIITA-B突变体由于Exon 11部分核苷酸缺失(40和199 bp)使终止密码子提前,从而致使编码CIITA蛋白的结构域受到了剪接的影响,缺失了末端富含亮氨酸的4个重复结构域,蛋白结构发生了明显的改变。进化树结果表明,针对CIITA,猪与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,在不同猪品种中具有较高的保守性。同时,CIITA不同剪接突变体在猪8种组织中均有表达,且表达量趋于一致,均在脾或肺中表达量较高,其次是肾、脊髓、甲状腺、肝、胸腺,在心脏中表达最低。本研究从SPF大白猪和长白猪上共获得了3个CIITA剪接突变体,其中两个蛋白结构缺失了4个富含亮氨酸的重复结构域,且不同剪接突变体在猪不同组织中均有表达,表达量稍有差异,为后续CIITA基因在机体内的免疫调控功能研究奠定了理论基础。

雄激素受体剪接突变体在去势抵抗性前列腺癌中的研究进展

2012年中国男性新发前列腺癌5.7万例，粗发病率为8.14/10万，世标率为5.90/10万，居男性新发恶性肿瘤的第7位。由于我国前列腺癌早期筛查并未普及，很多患者就诊时肿瘤已全身转移。在转移性前列腺癌中，针对雄激素受体（androgen receptor, AR）靶点的药物（如比卡鲁胺、戈舍瑞林等）是目前最有效的治疗手段，但是治疗的有效期一般只能维持12～24个月，很快就进展至去势抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer, CRPC）的阶段。

雄激素受体剪接突变体7和雄激素受体表达量的比值在预测前列腺癌内分泌治疗预后中的作用

目的分析雄激素受体（androgen receptor, AR）和雄激素受体剪接突变体7（androgen receptor splice variant-7, AR-V7）表达量的比值（AR-V7/AR）预测前列腺癌内分泌治疗预后的作用。方法采用免疫组化染色法检测2010年1月至2015年12月我院行内分泌治疗的136例前列腺癌患者的活检穿刺标本，以HS评分评估其表达量。患者年龄53～96岁，中位年龄71岁。确诊时中位tPSA为110.00 ng/ml（2.61～4 003.40 ng/ml），中位fPSA为14.62 ng/ml（0.12～640.19 ng/ml），中位PSA密度为1.15 ng/（ml·cm^3）[0.02～62.63 ng/（ml·cm^3）]。Gleason评分≥8分88例（64.7%），7分39例（28.7%），〈7分9例（6.6%）；T3期57例（41.9%），T4期54例（39.7%），Tx期25例（18.4%）；N0期46例（33.8%），N1期62例（45.6%），Nx期28例（20.6%）；M0期30例（22.1%），M1期97例（71.3%），Mx期9例（6.6%）。利用Cox模型分析患者各临床因素对前列腺癌内分泌治疗预后的影响，采用Kaplan-Meier法分析AR-V7/AR对前列腺癌内分泌治疗预后的预测作用。结果本组136例中79例（58.1%）AR表达阳性，其中26例（19.1%）AR-V7表达阳性。Spearman相关性分析结果显示，AR与AR-V7的表达无相关性（r＝0.042, P＝0.629）。本组136例中位随访时间为44个月（15～71个月）。中位疾病无进展生存时间（PFS）为19个月（5～59个月）；中位总生存时间（OS）为31个月（12～61个月）。AR-V7阳性患者较阴性患者有较短的中位PFS（10.8个月与25.0个月，P〈0.001）和中位OS（20.3个月与42.8个月，P〈0.001）；高AR-V7/AR值患者较低AR-V7/AR值患者有较短的中位PFS（12.0个月与24.8个月，P〈0.001）和中位OS（22.5个月与42.8个月，P〈0.001）。在Cox单因素回归分析中，确诊时Gleason评分、前列腺癌T分期、tPSA、PSA密度、AR-V7/AR值可预测内分泌治疗的预后。在Cox多因素回归分析中，T4期（HR＝2.597，95% CI 1.351～4.995，P＝0.004）和高AR-V7/AR值（HR＝5.788，95% CI 2.530～13.242，P〈0.001）是前列腺癌内分泌治疗预后不良的独立危险因素。结论高AR-V7/AR值是预测前列腺癌内分泌治疗预后不良的独立危险因素。AR-V7阳性、高AR-V7/AR值患者的中位PFS和OS均明显缩短。

EOLA1基因突变体的克隆和鉴定

目的 对ECV3 0 4细胞株EOLA1基因进行克隆测序以及mRNA水平检测。方法 采用RT PCR扩增EOLA1基因片断 ,连接到T载体进行测序。结果 测序发现一种目的基因mRNA剪接突变体 ,其第 3外显子起始部分比Genebank数据库相应序列多出 19个碱基。RT PCR显示剪接突变体与野生型EOLA1基因具有不同的表达水平和LPS反应性。结论 发现一个EOLA1基因剪接突变体 。

FHL1抗体的制备与特异性鉴定

目的:制备FHL1及其剪接体FHL1B、FHL1C的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:融合表达GST-FHL1蛋白,常规免疫小鼠,制备多克隆抗体。分别构建带有FLAG标签的FHL1-5、FHL1B、FHL1C以及FHL1N端和C端缺失突变体的真核表达载体。Westernblot检测抗体的特异性。结果:获得了FHL1-5、FHL1B、FHL1C及FHL1(1-169aa)和FHL1(168-280aa)的真核表达载体;得到的多克隆抗体可特异识别FHL1、FHL1B和FHL1C,而不识别FHL2-5;抗体与FHL1N端反应,而不与其C端反应。结论:成功得到可特异识别FHL1、FHL1B和FHL1C的多克隆抗体,为进一步研究FHL1及其剪接突变体的功能奠定了坚实的基础。

大电导钾离子通道(BK)结构与功能的研究进展

大电导钙离子激活钾通道(BK)是细胞膜上唯一接受细胞内Ca2+和膜电位双重调控的离子通道.最新发表的关于BK通道电镜结构及其胞质功能域的晶体结构的文章,第一次展示了BK通道各亚基的组装,并证实通道各功能域在通道门控机制中存在紧密的相互作用.近年来,针对BK通道的功能调节及其门控动力学模拟的研究取得较多进展,有助于更好地理解BK通道发挥生理功能的门控机制,并揭示BK通道相关疾病的病理生理学基础.

FAK突变体的亚细胞定位及生物学特性

目的探讨外显子33缺失型黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)突变体(FAK-Del33)的亚细胞定位及生物学特性。方法采用基础实验研究设计。将野生型FAK以及突变型FAK-Del33分别构建到pEGFP表达载体,并转染乳腺癌细胞株,以研究分析其细胞表达和定位情况。另构建过表达FAK或FAK-Del33的MDA-MB-468乳腺癌稳转细胞株,研究评价其细胞表达和体外克隆形成能力。结果构建FAK-GFP融合蛋白表达载体转染MDA-MB-468后的细胞定位显示,野生型FAK在胞浆中弥散分布,而FAK突变体蛋白在胞浆中呈点状不均匀分布,并聚集成簇。经限制性内切酶酶切分析与测序分析,成功构建出过表达FAK的慢病毒载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染乳腺癌细胞;经抗生素puromycin筛选和荧光定量PCR鉴定,成功筛选到稳定表达FAK的细胞株。在软琼脂克隆形成实验中,FAK野生型的克隆形成数为(335±48)/1000个,FAK突变体为(735±91)/1000个,后者对MDA-MB-468乳腺癌稳转细胞株的增殖能力高于前者(t=9.437,P<0.01)。结论初步研究表明外显子33缺失可改变FAK的亚细胞定位;并能增强肿瘤细胞株的体外克隆形成能力,这种FAK突变体可能参与肿瘤的发生发展。