截短绿色荧光蛋白突变体反式剪接修复核酶

Ⅰ型内含子核酶经过设计特定的信号引导序列(IGS),可特异性地定点剪接目的基因RNA,从而在RNA水平达到修复病变基因的目的。以四膜虫材料,克隆了其26SrRNA内含子核酶基因,体外转录证实该I型内含子核酶具有完全的自我剪接的功能。为检测该核酶的反式剪接功能,构建了缺失后半段564bp基因序列的绿色荧光蛋白(GFP)的截短突变体重组质粒XYQ5XYQ10pEGFPC2,并证实其失去了发射绿色荧光的活性。利用PCR和分子克隆技术,构建了以上EGFP突变体的反式剪接修复核酶ptransribCMV2,该核酶载体以克隆的26SRNA内含子为核心,选择EGFP编码区194位TG为剪接位点,以188193位设计IGS序列,核酶3′端携带195890bp的EGFP基因序列,连接于pRCCMV2真核表达载体中。体外转录突变EGFP的原核表达载体XYQ510pGEM和ptransribCMV2,以混合转录产物为模板进行RTPCR,电泳及测序证实产物中含有反式剪接修复的野生型EGFPmRNA,从而证实构建的反式剪接核酶具有体外反式剪接功能。将截短突变重组质粒XYQ5XYQ10pEGFPC2与核酶质粒ptransribCMV2共转染Hela细胞,用荧光显微镜观察转染结果,发现有少量共转染的Hela细胞发出绿光;RTPCR检测出野生型EGFPmRNA,证明构建的反式剪接核酶具有体内反式剪接的功能,但其反式剪接效率低。

利用外显子捕获技术从基因组片段中分离表达序列

本实验旨在以外显子捕获（ｅｘｏｎ－ｔｒａｐｐｉｎｇ）技术从人类５号染色体短臂（５ｐ）＂猫叫综合征＂区域分离表达序列。将来自５ｐ的基因组片段克隆进ｐＳＰＬ３剪接载体，用以转染ＣＯＳ－７细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增后，以ＵＤＧ法克隆剪接产物，并进行基因组来源、组织表达特异性及序列分析等鉴定。结果表明，基因组片段在实验系统中能被有效剪接，并得到了确为５ｐ来源的表达序列。证明外显子捕获技术能有效用于表达序列的筛选，但现有的剪接载体仍有较为严重的隐含剪接问题。