一起肉牛副流感病毒3型、巴氏杆菌、牛支原体混合感染的诊治

牛呼吸道综合征往往是多种病原体混合感染引起,致病机制复杂。云南省昆明市某肉牛养殖场部分犊牛出现了以咳嗽、气短、流鼻涕、腹泻等呼吸道症状为主要表现的呼吸道疾病,随后多头相继死亡,剖检主要病变为气管、胃黏膜、小肠出血,肺脏肝变,肝脏出血肿大,心脏出血,心包黏连等;经采病料用常见呼吸道疾病病原(牛病毒性腹泻病毒,牛冠状病毒,牛副流感病毒3型,牛呼吸道合胞体病毒,牛疱疹病毒1型,多杀性巴氏杆菌,溶血性曼氏杆菌,牛支原体)8联PCR检测试剂盒检测,结果为副流感病毒3型、多杀性巴氏杆菌、牛支原体混合感染。经用加米霉素、10%替米考星和20%氟苯尼考等大环内酯类药物治疗,结合加强饲养管理,多数病牛恢复了健康。

一株c基因型牛副流感病毒3型病毒的分离鉴定

从黑龙江省某牛场当中患有呼吸系统疾病的病牛鼻拭子中分离到一株病毒,该病毒在MDBK细胞上能够产生典型的病变。经免疫荧光鉴定表明成功分离到一株牛副流感病毒3型,命名为HLJ1。将病毒的M基因与GenBank中已发表BPIV3毒株的M基因进行同源性比较及系统进化分析,结果表明HLJ1与BPIV3c型参考毒株NX49的同源性最高为99.7%,因此HLJ1分离株属于c基因型BPIV3。我们的结果将为牛副流感病毒3型检测试剂盒及疫苗的研发工作奠定基础。

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta(DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell,MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID50及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^(-1),Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基因的转录上调。与对照组细胞相比,山羊IFN-α显著下调MDBK细胞中CPIV3的病毒滴度,Western blot结果显示,山羊IFN-α孵育显著下调CPIV3非结构蛋白C的表达水平。山羊IFN-α对CPIV3在MDBK细胞中的增殖具有显著抑制作用。本研究扩展了I型干扰素的研究范围,为CPIV3等反刍动物疫病的防控提供新的思路。

牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起牛呼吸道综合征的分析

为查明广西某牛场一起以呼吸道症状为主的病因,试验采用流行病学调查法、临床观察法、病理解剖观察法、病原分离培养和RT-PCR/PCR扩增法进行诊断,并对分离株进行药物敏感性试验。牛副流感病毒3型和牛支原体为阳性,牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒等为阴性。该起病例由牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起的,导致本场牛大批发病死亡的原因是由外购牛传染引起。

山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定

2013年下半年至2014年3月,江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病。采集不同发病场鼻拭子和血清样品,检测呼吸道相关病原,在大部分样品中检测到副流感病毒3型。将阳性病料接种于MDBK细胞,连续传代5代,经RT-PCR和血凝试验检测证实分离到病毒,命名为JS2013。扩增完整的M基因,进行进化分析表明该毒株不同于牛和人副流感病毒3型,具有独特的基因特征。这是国内外首次报道山羊源副流感病毒3型的分离鉴定。

牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究

目的针对黑龙江省近几年夏季奶牛经常发生以高热、气喘和流涎等症状为主的疾病,给畜牧业造成严重经济损失,本文旨在研究其病原因素及感染牛中和抗体的变化趋势。方法本研究采集爆发高热病的牛群中患病牛乳汁和鼻液进行病毒分离,经CPE和扫描电镜观察、理化特性试验、血凝试验、病毒中和试验以及RT-PCR方法鉴定分离的病毒,最后应用病毒中和试验跟踪监测5头典型发病牛中和抗体13个月。结果从病料中分离到一种RNA病毒,能够产生典型的细胞融合样CPE,有囊膜和栅栏样纤突,但是没有血凝性,能够与参考毒株牛副流感病毒3型抗血清发生病毒中和反应,HN基因的序列分析发现与牛副流感病毒3型HN基因同源性最高达99.6%。发病牛中和抗体跟踪监测结果显示康复期抗体效价是急性期的4倍以上,同时可见感染牛的中和抗体效价在6-8个月内能够维持在1:25～1:27,然后开始下降,最后维持在1:22～1:23之间。结论综上所述确定分离毒株是牛副流感病毒3型,进一步证实该病毒是引起本牛群高热病的病因之一,而且感染后中和抗体效价至少在6个月以内能够维持在较高的水平。

牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用

为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP(rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105。间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgG1/κ。特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应。免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原。该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件。

牛副流感病毒3型RT-LAMP检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)基因序列,利用在线软件Primer Explorer V4Software和Primer Premier 5.0,针对BPIV-3 NP基因序列的保守区设计并筛选了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立BPIV-3特异性检测的RT-LAMP方法。在Bst DNA聚合酶作用下,63℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物通过浑浊度比较、凝胶电泳和肉眼可视化进行判定。结果表明,该方法比RT-PCR敏感度更高,最低检出量可达0.069fg/μL。该方法可用于牛副流感病毒3型的实验室检测和临床初步诊断。

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。

牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛副流感病毒3型（BPIV3）双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）检测方法,本研究采用纯化的病毒分别免疫小鼠与家兔,制备鼠抗BPIV3单克隆抗体（MAb）与兔抗BPIV3多克隆抗体（PAb）。以纯化的兔抗BPIV3 PAb作为包被抗体,鼠抗BPIV3 MAb作为检测抗体,采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件。结果显示,纯化的兔抗BPIV3 PAb与鼠抗BPIV3 MAb的效价分别为1：25 600和1∶12 800,均可与BPIV3病毒蛋白特异性结合。建立的DAS-ELISA方法捕获抗体最佳包被浓度为10μg/m L,37℃孵育1 h;检测抗体最佳工作浓度为2.5μg/m L,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min。判定的临界值为0.451。本研究建立的DAS-ELISA方法与牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒均无交叉反应,特异性较强。检测下限为103TCID50。批间和批内变异系数均小于10%,具有良好的重复性。利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测,两者符合率为94.6%。本研究建立的检测BPIV3的DAS-ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的miRNA表达谱变化分析

本研究旨在分析山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞和正常MDBK细胞差异表达的miRNA,以探索miRNA在CPIV3感染过程中的作用及其调控机制。将CPIV3感染MDBK细胞,利用高通量测序技术检测分析MDBK细胞中miRNA表达谱,并筛选差异表达的miRNA。对靶基因进行GO注释和KEGG富集。结果显示,有37个miRNA显著差异表达(P<0.001),其中18个miRNA在病毒感染中上调,19个miRNA在病毒感染中下调。经RT-qPCR方法验证5个差异表达的候选miRNA,结果与高通量测序分析有很好的一致性。进一步GO功能注释表明:差异表达的miRNA靶基因生物学功能相对集中在免疫调节、细胞生物调控及细胞新陈代谢等生物过程。这些靶基因参与多种细胞的信号通路,包括细胞黏附分子、B细胞受体信号通路、MAPK信号通路、代谢通路、黏合斑、钙离子信号通路和趋化因子信号通路等。本研究为进一步探讨CPIV3致病机制奠定了基础。

呼吸道合胞病毒、副流感病毒3型毛细支气管炎患儿鼻咽分泌物趋化因子水平的比较

目的探讨趋化因子在呼吸道合胞病毒(RSV)及副流感病毒3型(PIV3)所致毛细支气管炎发病机制中的作用,比较两种病毒感染对其表达的影响。方法毛细支气管炎患儿40例,入院24 h内收集其鼻咽分泌物(NPS),应用直接免疫荧光法检测RSV和PIV3抗原。对照组为行心导管检查术和腹部手术的患儿14例。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定NPS中调节活化正常T细胞表达及分泌的趋化因子(RANTES)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、IL-8水平。结果RSV阳性26例,PIV3阳性14例。PIV3感染患儿RANTES、MIP-1α及IL-8水平均高于RSV感染组,但差异无显著性(Z=0.551,0.357,0.169 Pa>0.05)。RSV及PIV3感染组RANTES、MIP-1α、IL-8水平均明显高于对照组(Z=3.65,4.10,4.22;Z=4.13,4.85,5.08 Pa<0.001)。RSV感染组RANTES、MIP-1α、IL-8间均呈显著正相关(P<0.01,0.05);PIV3组IL-8与MIP-1α及RANTES均呈显著正相关(Pa<0.01),RANTES与MIP-1α无相关性。结论RSV与PIV3感染有相似的免疫发病机制。趋化因子可能在其发病机制和呼吸道炎症中起重要作用。

北方三省(区)牛副流感病毒3型的血清学调查

为了解我国北方三省(区)牛副流感病毒3型(BPIV3)的感染状况,从内蒙古、吉林、山西3个省采集牛血清样品482份。采用病毒中和试验方法进行BPIV3抗体检测。结果显示,482份血清中BPIV3阳性共439份,阳性率为91.08%。吉林、内蒙、山西3省区中血清BPIV3阳性率分别97.35%、84.31%、95.15%。研究表明,中国北方三省(区)牛群中普遍存在BPIV3的感染。

牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法。结果显示,方法可同时扩增出BPIV3A型150bp、B型253bp和C型342bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×104、0.92×104和1.53×104拷贝/μL。本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型。

牛副流感病毒3型RT-PCR检测方法的建立

参照GenBank中公布的牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV-3)全基因序列,针对BPIV-3特异性NP蛋白保守基因设计一对引物,建立了BPIV-3的RT-PCR诊断方法。其最佳扩增退火温度为58.1℃,引物浓度为1.0μmol/L。采用该方法扩增BPIV-3参考病毒,能扩增出425bp预期大小的特异性片段,而扩增牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛合胞体病毒、猪瘟病毒以及牛支原体、大肠埃希氏菌、牛巴氏杆菌和沙门氏菌等常见病毒和细菌均呈阴性结果。对参考病毒进行梯度稀释检测,结果证明该法检测BPIV-3的灵敏度可达10-3TCID50/0.1mL。

副流感病毒3型感染肺炎患儿细胞免疫功能分析

目的分析副流感病毒3型感染肺炎患儿外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞及NK细胞的变化。方法对入院儿童行痰病原学检测7种常见病毒抗原,明确病原学诊断,并用流式细胞仪检测副流感病毒3型感染患儿外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞及NK细胞值。结果副流感病毒3型肺炎患儿外周血CD16+CD56+T细胞百分率较对照组减少,CD3+T细胞百分率、CD4+T细胞百分率、CD8+T细胞百分率、CD19+CD21+B细胞百分率和对照组相仿,CD4+/CD8+比值较对照组升高。结论副流感病毒3型感染肺炎患儿细胞免疫功能紊乱。

牛副流感病毒3型实验室检测方法研究进展

牛呼吸道疾病综合征是引起世界范围内饲养牛发病和死亡的主要原因,严重危害着世界养牛业的发展。牛副流感病毒3型是引起牛呼吸道疾病综合征的主要病原之一,主要引起成年牛和犊牛的肺炎、支气管肺炎等。文章综述了近年来牛副流感病毒3型的最新实验室检测方法研究进展,以期为预防和控制疾病提供参考。

我国牛副流感病毒3型血清学调查

为了解我国牛副流感病毒3型(BPIV3)的流行情况,本研究从黑龙江、辽宁、新疆、云南、贵州、广西、河北、山东、河南、江西、湖南和福建12个省份采集牛血清样品2 489份,并采用血清中和试验进行BPIV3抗体检测,结果显示除江西省血清样品阳性率为27.8%之外,其他省份阳性率均高于50%;2 489份血清样品中阳性样品数为1 932份,总体阳性率为77.6%。结果表明BPIV3在我国流行比较广泛,本研究的调查数据为我国BPIV3的防制提供重要的依据。

牛副流感病毒3型研究概述

牛副流感病毒3型(BPIV3)是引起牛呼吸系统疾病的主要病原,广泛分布于世界养牛业发达地区,BPIV3常与其他病毒或细菌混和感染或继发感染,对养牛业造成巨大的经济损失。此文从BPIV3的分子结构、致病机制、免疫逃避、种间传播、病毒病诊断与防控等方面介绍BPIV3的研究概况,为该病毒的基础研究及相关疾病的防控提供参考。

绵羊副流感病毒3型PE2019株的分离与鉴定

为了确定引起绵羊呼吸道传染病的病原,本研究于2019年对一患急性呼吸道疾病死亡绵羊的病料进行了病毒分离,从其胸腔积液中分离到一株绵羊副流感病毒3型(OPIV3),命名为PE2019株。该病毒能够在MDBK细胞上增殖,产生细胞圆缩、集聚成簇等为特征的细胞病变;电子显微镜观察可见OPIV3 PE2019株为直径约300 nm的圆形粒子;经检测该分离株病毒滴度为107.8TCID50/mL。分离株对小鼠和豚鼠的红细胞血凝价均为164,不凝集鸡、兔、绵羊和牛的红细胞。参考山羊副流感病毒3型全基因组序列(MK091103),设计其N和M基因特异性引物,通过RT-PCR可从病毒细胞培养物中扩增到特异性片段,对其进行序列分析,结果显示,分离株N基因序列与山羊、牛和人副流感病毒3型参考株的基因同源性分别为84.0%、82.1%和78.8%,M基因序列与山羊、牛和人副流感病毒3型参考株的基因同源性分别为81.5%、78.4%和77.6%,OPIV3 N和M基因均为独立一个分支。本研究首次于国内分离到OPIV3,为了解国内OPIV3的流行情况及疫苗的研制奠定了基础。