凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的表型及分子特征

采用常规的形态及生理生化特性检验及分子生物学等方法,对引起凡纳滨对虾幼虾发生毁灭性死亡的病原菌进行了致病性、表型生物学及分子生物学的系统研究。结果表明,分离菌为弧菌属(Vibrio Pacini 1954)的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),对凡纳滨对虾、中国对虾及日本对虾仔虾均有强致病性。分离鉴定的4株副溶血弧菌具有淀粉酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有蛋白酶、脂肪酶活性,KP溶血均呈阴性,且均具有K抗原;代表菌株(JGB080708-1株)的16S rRNA基因序列(长度为1456bp,GenBank登录号为GQ205448)和gyrB基因序列(长度为1195bp,GenBank登录号为GQ205453)与副溶血弧菌的两种基因序列相似性均可达98%以上。病原菌的耐药性检测结果显示,对供试49种抗菌药物中的林可霉素等6种药物耐药。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)tdh2基因和鳗弧菌(V.anguillarum)ompU基因二联DNA疫苗制备及其对大菱鲆(Scophthalmus maximus)免疫保护作用

采用基因工程的方法,将副溶血弧菌的热稳定直接溶血素基因tdh2和鳗弧菌外膜蛋白基因ompU进行融合,在大肠杆菌中得到表达,并利用该融合基因构建二联DNA疫苗pEGFP-N1/tdh2-ompU。用DNA疫苗按10和50μg/尾的剂量通过肌肉注射免疫大菱鲆,对大菱鲆抵抗致病性副溶血弧菌和鳗弧菌的免疫效果进行研究。结果表明,DNA疫苗免疫的大菱鲆对副溶血弧菌感染的最高保护率为100%,对鳗弧菌感染的保护率为35%。被免疫的大菱鲆肌肉组织中能检测到融合蛋白表达,在血清中能检测到较高水平特异性抗体,DNA疫苗引起的体液免疫反应水平和保护效果与注射剂量有关。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中溶源噬菌体与其宿主菌致病力的相关性

急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)是由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的对虾病害,本研究从患AHPND的凡纳滨对虾样品中分离得到5株副溶血弧菌,采用致AHPND的副溶血弧菌(VPAHPND)的相关质粒的引物AP2进行PCR检测,表明这5株菌中均存在AHPND相关质粒。利用丝裂霉素C进行溶源性噬菌体筛选和噬菌体诱导发现,其中2株副溶血弧菌(20130629002S01和20130726001S01)可能存在溶源性噬菌体感染;从经0.5μg/ml丝裂霉素C诱导的20130629002S01和20130726001S01中分别分离得到两种噬菌体phage1和phage2。透射电镜观测显示,phage1为有尾噬菌体,phage2为球形噬菌体。将上述5株副溶血弧菌进行卤虫无节幼体人工感染实验,结果显示,它们对卤虫无节幼体均有致病力,且各分离株的毒力表现出显著性差异;20130629002S01和20130726001S01两株带有溶源性噬菌体的副溶血弧菌的致病力显著低于无噬菌体的副溶血弧菌(20130721001S02)。本研究结果表明,5株VPAHPND分离株都含有AHPND相关的质粒,表现出显著的毒力差异,可能携带不同的溶源噬菌体,也可能不携带溶源噬菌体,溶源噬菌体与副溶血弧菌各分离株的毒力并无必然相关性。

含副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) Fla I基因真核表达重组质粒的构建

用ClaⅠ /EcoRⅠ双酶切带有副溶血弧菌 (Vibrioparahaemolyticus)极鞭毛蛋白FlaI基因的质粒pMD18 FlaI,回收目的基因片段 ,插入到真核细胞表达载体pIRESneo同样经ClaⅠ /EcoRⅠ切开的窗口中 ,成功地将FlaI克隆到pIRESneo中 ,获得有意义的重组质粒pIRESneo FlaI.构建的pIRESneo FlaI真核表达重组质粒 。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaⅠ基因的合成及其克隆与鉴定

根据副溶血弧菌野生型菌株BB22 FlaⅠ基因cDNA序列,通过合理的引物设计、链延伸反应、PCR反应以及分子克隆等技术,成功地合成出编码极鞭毛蛋白的FlaⅠ基因全长片段,并将其克隆至pMD18-T载体质粒上.序列分析和酶切鉴定显示FlaⅠ基因得到了正确的合成和克隆.

以16S和16S—23S rDNA间区为靶区建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)PCR快速检测技术

提要应用BLAST程序和DNAstar软件,比较分析了5株副溶血弧菌和其他细菌的16S—23S rDNA间区序列,选取IGSIA作为扩增靶区,结合相邻的16S rDNA序列,设计合成了一对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速检测副溶血弧菌的PCR方法,对其特异性和敏感性进行了探讨,并初步进行了应用研究。结果表明,新建的PCR方法能特异性地扩增出大小为306bp和552bp的2条带,分别对应于副溶血弧菌的IGS0和IGSIA,检测灵敏度为5.6×102CFU/ml,半个工作日即可得到准确的结果,能有效检测出在杂色鲍、凡纳滨对虾和各种水质中的副溶血弧菌,适用于海洋水产动物副溶血弧菌病的早期快速诊断、水产品的检疫及水质环境的监测。

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血淋巴cDNA文库构建及表达序列标签初步分析

利用SMART技术构建副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血淋巴cDNA文库。结果表明,该文库的滴度为1.04×107CFU/mL,文库总容量达1.144×107CFU,克隆子插入片段大小为500—2000bp,重组率达98%。将随机挑选的300个阳性克隆测序,经过质量控制和拼接,共得到141个单基因组簇(UniGenes),75个UniGenes与NCBI非冗余蛋白质数据库中登录的蛋白质序列存在显著相似性,其中20个与免疫防御相关,如kazal-like丝氨酸蛋白酶抑制剂类蛋白、kazal-type蛋白酶抑制剂arasin-like蛋白、抗内毒素因子、抗微生肽、金属硫蛋白、铁蛋白、类70kD热休克蛋白等,达总测序数的6.67%。研究结果证实,构建cDNA文库是获得拟穴青蟹免疫相关基因的可靠途径。

副溶血弧菌VP-5的分离鉴定及其与鲈鱼免疫信号通路相互关系研究

本文以染病鲈鱼为试验材料,对其肝脏的致病菌进行分离、纯化、鉴定,并分析了致病菌与鲈鱼免疫信号通路的相互关系。结果表明,经分离、纯化,从染病鲈鱼肝脏中得到一株菌株VP-5。VP-5呈球杆状、弧形,有单鞭毛,运动活跃,为革兰氏阴性菌,对酪氨酸、葡萄糖、甘露醇等反应阳性,对蔗糖、阿拉伯糖和棉子糖等反应阴性,其16S rRNA和TDH1基因序列与副溶血弧菌的亲缘关系非常接近。经综合鉴定,致病菌VP-5为副溶血弧菌。鲈鱼受到副溶血弧菌VP-5感染后,免疫信号通路基因CD63、CXCR4、IL-8在鲈鱼肝脏组织中12 h和24 h时的相对表达量与无菌生理盐水对照组(CK)相比差异显著(P<0.05);在表皮组织中24 h和36 h时的相对表达量与无菌生理盐水对照组(CK)相比差异显著(P<0.05)。证实鲈鱼肝脏组织免疫信号通路基因的表达与副溶血弧菌VP-5的感染正相关,相对于表皮组织反应更快。鲈鱼的免疫信号通路基因CD63、CXCR4、IL-8积极反应于致病菌,这些基因的快速表达会引发鲈鱼自身免疫应答,增强鲈鱼抵抗致病菌的能力。

一株副溶血弧菌噬菌体VPp1的分离鉴定及裂解性能

为探究副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生物防治方法,从水产品市场处污水中分离出一株副溶血弧菌噬菌体VPp1。并借助噬菌斑形态、电镜、酶切等技术对其进行了分类鉴定,同时测定了其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线以研究其裂解性能。分类鉴定结果表明,其核酸是线型双链DNA,大小在15 kb左右。具有一个正二十面体的头部,头部直径大约为44 nm,无尾,属盖噬菌体科(Tectivirus);裂解性能研究结果表明,其在双层平板上培养12 h可形成中心清亮的噬菌斑,周围有大而明显的晕环。最佳感染复数为0.0001,潜伏期为10 min,裂解量为90.3,是符合条件的潜伏期短裂解量大的理想噬菌体,可用作进一步的应用。

副溶血弧菌特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)对凡纳滨对虾幼体被动免疫和育苗成活率的影响

将抗高致病性副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)应用于育苗生产,通过测定氨氮、亚硝酸盐、细菌总数、弧菌总数、相对保护率和育苗成活率,评价了AHPND-VpIgY在育苗期对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)幼体的保护效果。结果表明,0.1g/m3和0.2g/m3AHPND-VpIgY组的相对保护率为35.7%和57.2%,两者均显著高于非特异性卵黄抗体组(P<0.05);两组的育苗成活率为50.8%和57.2%,比对照组分别提高19.1%和25.6%。各实验组氨氮、亚硝酸盐、细菌总数及弧菌总数与对照组无显著差异,对水质无影响。综上,特异性的AHPND-VpIgY能在不改变水质的前提下,有效提高凡纳滨对虾幼体的存活率、相对保护率和育苗成活率,从而提高凡纳滨对虾苗种产量和质量。

双重PCR在创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytious)快速检测中的应用

建立双重PCR方法检测海产品中的创伤弧菌(Vbrio vulnificus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytious)。针对创伤弧菌和副溶血弧菌的gyrB基因的不同位点设计引物,前者扩增片断的大小为968bp,后者扩增片断的大小为284bp。共对三种海产品进行了创伤弧菌和副溶血弧菌的检测,结果在部分海产品中能特异性地检测到目标菌株。该方法快速,灵敏度高,特异性强。为海产品的创伤弧菌和副溶血弧菌的检测提供了有效的方法。

不同诱导条件下的VBNC状态副溶血弧菌的PMA-qPCR定量检测及其呼吸活性分析

定量检测不同诱导条件下的活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态副溶血弧菌的变化情况,并对VBNC菌的呼吸活性进行分析。采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q PCR)结合的技术(PMA-q PCR)定量检测副溶血弧菌活菌数。结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪优化传统CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)呼吸检测法对VBNC状态的副溶血弧菌进行分析。结果表明PMA-q PCR检测技术结合平板计数的方法,可用于定量检测副溶血弧菌诱导过程中活菌数和可培养菌数的变化情况,并利用差值测定出VBNC细胞的浓度。在不同的温度、Na Cl含量和氯霉素含量的诱导条件下,副溶血弧菌在其中的7种条件下在60 d内进入了VBNC状态。VBNC细胞终浓度最低为5.75×10~2 CFU/m L,最高为1.70×10~5 CFU/m L。在细胞呼吸实验中,采用CTC与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)双染法能在激光扫描共聚焦显微镜下清晰地观察到VBNC细胞表面的红色荧光,有效区分死活细胞。同时利用流式细胞仪能够根据荧光强度快速区分呼吸活性呈阴性和阳性的细胞。本研究为VBNC细菌的检测和生理特性的研究提供了新的思路和依据。

副溶血弧菌QsvR ChIP-qPCR方法的建立

目的:建立副溶血弧菌QsvR的染色质免疫共沉淀实时定量PCR(ChIP-qPCR)实验方法。方法:通过热激转化和转化结合将标记2×Flag标签的qsvR片段转入qsvR突变株(ΔqsvR)中,阿拉伯糖诱导表达QsvR-2×Flag蛋白,通过甲醛与基因组DNA进行交联形成2×Flag-QsvR-DNA复合物,将基因组DNA超声裂解为100~1000 bp大小不等的片段,通过特异性抗原抗体反应将蛋白质-DNA复合物沉淀下来,高盐和加热解交联,回收DNA进行qPCR定量DNA,分析副溶血弧菌体内QsvR与靶基因的结合情况。结果:成功构建出实验菌株ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag,以不加阿拉伯糖诱导为对照,经阿拉伯糖诱导菌株的aphA、opaR、exsB和vtrA的免疫共沉淀量明显较高,表明在副溶血弧菌体内QsvR与aphA、opaR、exsB和vtrA具有结合作用。结论:成功建立了副溶血弧菌QsvR的ChIP-qPCR实验方法,可用于原核生物体内蛋白质-DNA相互作用的研究。

副溶血弧菌外膜蛋白A(VP0764)的分析表达及其免疫保护效果初步评价

外膜蛋白A(OmpA)为副溶血弧菌主要表面蛋白之一,具有较强的免疫原性,在疫苗上有很好的应用前景。为评价副溶血弧菌OmpA的免疫效果,本研究通过PCR方法获得副溶血弧菌SH112株的ompA(VP0764)基因的全长片段,测序结果显示该蛋白编码区全长990 bp。对其编码蛋白质进行生物信息学分析,结果显示该蛋白是含有信号肽的稳定蛋白,无跨膜结构,有11个抗原决定簇,具有较高免疫原性。扩增去除信号肽序列的成熟蛋白基因903 bp,并构建重组表达载体pET28a-ompA进行原核表达,结果显示,获得分子量约为39 ku的重组蛋白HisOmpA(VP0764)。采用该蛋白免疫ICR小鼠(0.1 mg/只)3次后收集血清制备鼠多克隆抗血清,利用ELISA检测抗血清效价,结果显示制备的鼠多克隆抗血清效价达132 000以上。利用western blot检测制备的鼠多克隆抗血清,结果显示该血清可与表达蛋白和全菌蛋白发生特异性反应,表明所表达的目的蛋白具有良好免疫原性,能识别天然OmpA蛋白。将45只8周龄ICR小鼠随机分成3组,分别免疫灭活的SH112全菌疫苗(1×108cfu/只)、His-OmpA(VP0764)重组蛋白(0.1 mg/只)及PBS(200μL/只),每两周免疫一次,三免后10 d采用副溶血弧菌SH112株(2×107cfu/只)攻毒,结果显示免疫SH112全菌和His-OmpA(VP0764)重组蛋白的实验组小鼠免疫保护率分别是73%和40%,与对照组差异显著。本研究为副溶血弧菌OmpA的功能与疫苗开发研究奠定了基础。

粪肠球菌JSHY-R5对致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌的拮抗作用

以致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌为受试菌株,从采集自江苏沿海地区的健康凡纳滨对虾体内分离筛选拮抗菌株,通过形态学、生理生化及分子生物学方法进行鉴定,测定其对受试菌株的拮抗效果,并对被动保护效果进行分析。结果显示,筛选出1株对致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌有良好抑制效果的菌株JSHY-R5,经形态特征、生理生化及16S rDNA序列分析鉴定该菌株为粪肠球菌。当JSHY-R5与致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌以5∶1的接种比例共培养时,JSHY-R5对致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌具有明显的抑制作用。此外,饲料添加JSHY-R5处理的凡纳滨对虾体内副溶血弧菌黏附因子(VpadF)mRNA的表达量显著下调,对虾免疫因子(Serpin、Hemocyanin、Peneidins)mRNA表达量显著升高,暴露在致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌下的5 d存活率相比投喂常规饲料的阳性组提高26%。本试验证实筛选的粪肠球菌JSHY-R5对致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌具有较好的抑制作用,可以抑制副溶血弧菌黏附因子的mRNA表达,调节免疫因子的表达,增强宿主免疫防御能力,从而提高对虾的存活率,具有应用为饲料添加剂的潜力。

致病性副溶血弧菌VP0630株的分离鉴定及其对凡纳滨对虾免疫酶活力的影响

为分析天津地区养殖凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei暴发性死亡的原因,采用生理生化法、16S rRNA基因序列分析及AP4套式PCR方法对从患病凡纳滨对虾(体长5~6 cm)肝胰腺中分离得到的优势菌VP0630进行了病原菌分离鉴定和致病性研究,采用注射感染法对凡纳滨对虾进行攻毒试验,试验设对照组和感染组,每组设3个平行,每个平行各30尾对虾,感染组每尾虾注射3×10^7 CFU/mL的副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus 25μL,分别于注射后3、6、9、12、24、48、72、96 h时,检测凡纳滨对虾体内免疫酶活力的变化情况。结果表明:经鉴定,优势菌株VP0630属于致病性副溶血弧菌,理化特性鉴定概率为99%,pir毒力基因检测呈阳性;注射感染试验显示,对虾96 h时的累积死亡率达78.37%;酶活力检测显示,对照组对虾血清和肝胰腺中溶菌酶(LYS)、酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)和总抗氧化能力(T-AOC)6种酶活力在0~96 h时无显著性变化(P>0.05),而感染组对虾6种酶活力均呈现先升高后降低趋势,血清和肝胰腺中6种酶活力均在6~12 h时显著升高(P<0.05),大部分酶活力在72~96 h时降低至对照组水平,仅个别酶活力显著低于对照组(P<0.05)。研究表明,副溶血弧菌VP0630株具有较强的致病性,对凡纳滨对虾免疫防御系统有较强的破坏作用。

副溶血弧菌lux报告基因系统的建立与应用

目的:建立副溶血弧菌的lux报告基因融合实验平台,为后续研究基因转录调控机制奠定基础。方法:采用PCR扩增opaR的启动子区序列,并将其克隆入pBBRlux质粒中,构建重组质粒opaR-lux。将opaR-lux重组质粒分别转入野生株(WT)、opaR突变株(ΔopaR)和aphA突变株(ΔaphA)中,检测特定培养条件下三者发出的冷光值(Lux)以及在600 nm处的吸光度值(OD600),以“Lux/OD600”表示单位OD600下的相对平均冷光单位(relative light unit,RLU)。通过比较各菌株的RLU大小,判断OpaR和AphA对opaR的调控关系,以检验实验平台的稳定性。结果:成功构建出带有opaR的pBBRlux重组质粒;在低密度(OD600<0.4)时,AphA负调控opaR的转录,当细菌达到高密度(OD600=0.8)时,AphA则对opaR的转录不起调控作用;在细菌从低密度生长到高密度(即OD600<0.8)中,OpaR对自身的转录存在负调控作用。结论:成功建立了副溶血弧菌的lux报告基因融合实验平台,用于后续转录调控机制的研究。

副溶血弧菌OpaR转录调控元研究

文章旨在探究OpaR在生物膜形成条件下的转录调控机制。通过对野生型和opaR基因突变株的转录组数据进行比较,发现OpaR共调控了2243个基因的转录,其中1164个下调,1079个上调。功能富集分析结果显示,这些基因涉及分子功能、细胞组分、生物学过程等方面。代谢途径分析结果表明,差异表达基因主要涉及细胞代谢通路和环境信息处理。此外,从数据中还筛选出了多个与生物膜形成相关的基因。这些发现为理解OpaR调控生物膜形成的分子机制提供了重要信息和参考。

副溶血弧菌VopS效应子基因的克隆与原核表达

副溶血弧菌可通过Ⅲ型分泌系统分泌效应毒力蛋白导致真核靶细胞的细胞溶解及细胞凋亡.VopS是Ⅲ型分泌系统中的一个效应毒力因子,能通过抑制NF-κB的活性介导巨噬细胞死亡.实验将效应因子VopS的编码基因克隆到pET28a(+)载体上,成功构建了pET28a(+)-vopS重组质粒,将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE分析,发现在分子量约为43kDa处有一明显蛋白表达条带.用Ni 2+-NTA柱亲和层析获得纯化蛋白,浓度为175mg/L.为进一步研究副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统致病机制提供了材料.