水产品中副溶血性弧菌的污染、毒力基因及耐药性研究

采集上海市各大农贸市场3类水产品共273份,分离出副溶血性弧菌105株,平均检出率为38.46%,其中甲壳类、贝类、鱼类检出率分别为50.96%、27.12%、15.79%,三者间有极显著差异(P<0.01)。多重PCR检测分离菌株发现所有分离菌株没有耐热直接溶血毒素和相对耐热直接溶血毒素基因,仅有不耐热溶血毒素基因。K-B氏药敏纸片法检测了105株分离菌株对10种抗生素的耐药性,发现所有菌株对头孢曲松、萘啶酸和诺氟沙星敏感,部分菌株对氨苄西林(69.50%)和阿莫西林(12.38%)等具有较强的耐药性。另外采用碱裂解法提取所有分离菌株的质粒,发现只有7株菌株含有1～3个质粒,大小范围在1～24kb之间,且菌株耐药性与其所携带的质粒的数量和大小并无直接联系。表明分离菌株的耐药性主要是由于细菌染色体相关基因突变造成的。

副溶血性弧菌tdh基因的分子信标PCR技术检测

目的采用分子信标PCR技术进行副溶血性弧菌tdh基因检测。方法在反应体系中加入分子信标探针。对13株副溶血性弧菌和其他细菌分别进行tdh基因实时和终点法荧光检测。结果2株副溶血性弧菌和阳性质粒的终点法检测荧光值分别为114．9，95．2，90．0。实时PCR检测的CT值分别为26．2，26．8，32．0。其他肠道细菌终点法检测荧光值为47．0～69．1；CT值〉32．0或无值，与琼脂糖电泳分析结果一致。结论分子信标PCR技术可以准确、快速、实时、简便地进行副溶血性弧菌tdh基因检测。

副溶血性弧菌和溶藻弧菌的双重PCR检测技术

主要针对副溶血性弧菌（VpBJ1997）和溶藻弧菌（VaATCC17749）的gyrB基因的不同位点设计特异性引物，利用双重PCR技术同时检测Vp（BJ1997）和Va（ATCC17749），并对该反应体系的特异性以及灵敏度进行检测。结果显示Vp（BJ1997）灵敏度的检测下限可达2×10^2CFU／mL，Va（ATCC17749）灵敏度的检测下限可达2．03×10^2CFU／mL，双重PCR与单一PCR检测的灵敏度的数量级是相同的；与沙门氏菌（ATCC27892）、金黄色葡萄球菌（ATCC13565）、大肠杆菌（35218）、河弧菌（H265）、鳗弧菌（M936）、创伤弧菌（ATCC27562）无交叉反应；在人工污染试验中，混合菌液的检测下限2．84×10^3CFU／mL，而进一步稀释至2．84×10^2CFU／mL时，Vp（BJ1997）已检测不出，Va（ATCC17749）仍可检出。研究表明，该方法特异性强，灵敏度高，操作简单，成本低，检测速度快，为基层单位同时检测副溶血性弧菌和溶藻弧菌提供了一种快速准确的方法，对控制水产品中这两种致病性弧菌具有重大的意义。