1株5型副猪格拉菌的分离鉴定及生物学特性研究

副猪格拉菌是猪的一种重要病原菌,给世界养猪业带来较大的危害和经济损失。开展副猪格拉菌的分离鉴定及特性分析研究工作,有助于为临床诊断治疗及预防提供依据。该试验对临床发病的仔猪病料进行细菌分离培养鉴定,采用革兰氏染色、生化鉴定、PCR扩增、测序比对、遗传进化分析、基因分型等方法对分离菌株进行鉴定分析,同时对其进行药敏试验及致病性研究。结果显示,分离得到副猪格拉菌,同源性分析结果显示该菌株与副猪格拉菌不同参考菌株之间的相似性介于92.3%~95.6%,基因分型显示分离株为基因型5型。分离菌株对多西环素、阿莫西林敏感,对新霉素、泰乐菌素、复方新诺明和头孢噻吩耐药。小鼠致病性试验显示其具有致病性。本试验相关结果为副猪格拉菌临床防控及治疗提供理论依据。

保育仔猪猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染的诊疗

为查清山西省吕梁市中阳县某猪场从山东购买的保育仔猪大量出现的急性死亡、关节发炎、呼吸困难、高热等症状的病原,无菌采集病猪并带回实验室进行临床剖检,随后采集血液、淋巴结、肺、肾脏和脾脏进行实验室诊断,做出初步判断,制定综合防治策略,病情得到控制。本研究采用灵敏度和准确度较高的实时荧光PCR技术定性检测病料样品中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和副猪嗜血杆菌(HPS)。结果表明:中阳县某猪场保育仔猪为PCV2与HPS混合感染。基于诊断结论对保育猪免疫治疗程序和消毒进行合理调整,综合防治13 d后,猪群无新增发病率和新增死亡率,最大程度地减少了经济损失。本研究为猪场后续的治疗与预防提供了诊断依据。

副猪格拉瑟菌4个抗原蛋白的小鼠免疫保护效力比较

为筛选可用于副猪格拉瑟菌(GPS)亚单位疫苗的优势保护性抗原,本研究利用原核表达系统表达GPS的CyaY、SmpA、AfuA和OppA14个抗原的重组蛋白,采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化这4个重组蛋白后,通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达及纯化效果,采用western blot检测各重组蛋白的反应原性。SDS-PAGE检测结果显示,4个重组蛋白r CyaY、r SmpA、rAfuA和rOppA1的分子量分别约为12 ku、16 ku、41 ku和62 ku,均主要以可溶性形式表达,其表达量占菌体总蛋白的16.50%~26.50%。4个重组蛋白的纯化效果均较好,其浓度介于1.00 mg/mL~4.00 mg/mL。Western blot结果显示,rOppA1和rAfuA与GPS猪阳性血清的反应原性最强,rCyaY的反应原性中等,rSmpA的反应原性最弱。采用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定4个重组蛋白的浓度后分别与ISA 201佐剂混合制成疫苗,对小鼠经皮下注射方式免疫2次,分别在小鼠免疫前、首免后21 d和二免后14 d采血,采用间接ELISA方法检测各组小鼠血清中的抗体水平;二免后14 d分别以5 LD_(50)(8.40×10^(8)cfu)和10 LD_(50)(1.68×10^(9)cfu)的5型GPS H5L3株对小鼠经腹腔攻毒,统计各重组蛋白疫苗对小鼠的免疫攻毒保护率。ELISA结果显示,各重组蛋白疫苗免疫组小鼠血清中IgG抗体水平随免疫次数的增加而升高,且均与PBS对照组抗体水平差异极显著(P<0.01)。小鼠攻毒试验结果显示,采用5 LD_(50)H5L3株攻毒后,rCyaY、rSmpA、rAfuA和rOppA1蛋白疫苗对小鼠的免疫保护率分别为83.3%(5/6)、83.3%(5/6)、33.3%(2/6)和100%(6/6);采用10 LD_(50)H5L3株攻毒后,rCyaY、r SmpA和rOppA1蛋白疫苗仍能对小鼠提供33.3%(2/6)、16.7%(1/6)和50%(3/6)的免疫保护率,但rAfuA蛋白疫苗不能为小鼠提供有效的免疫保护力(0/6)。本研究首次在相同条件下表达了GPS的4个重要保护性重组抗原蛋白rCyaY、rSmpA、r AfuA和r OppA1,并评价了它们对小鼠的免疫保护效力,证实rOppA1具有成为亚单位疫苗候选抗原的潜力,该研究为GPS亚单位疫苗的研发提供了更多的参考依据。

副猪格拉瑟菌的荚膜分型方法及原理研究进展

副猪格拉瑟菌(GPS)是猪的重要病原菌之一,自1910年被确认为猪格拉瑟病的病原以来,血清型鉴定是GPS研究领域长期以来的“卡脖子”环节。1992年,基于GPS热稳定抗原的凝胶免疫扩散试验(GID)分型方法首次将GPS分为1-15型,但有约25%的菌株不可分型,当时对于其分型抗原的成分也不明确。2003年,基于GPS的“盐水提取物”抗原建立了GPS的间接血凝试验(IHA)分型方法,其敏感性和分型率均高于GID,但仍有约15%的菌株不可分型。IHA和GID方法的分型结果基本一致,因此能够确定两者的分型抗原是基于相同的GPS表面多糖成分,但仍不能确定是荚膜多糖,或是LPS,甚或是其他多糖物质。2013年,1-15型GPS荚膜多糖的合成基因簇得到成功解析,证实其血清型抗原形成的本质是荚膜多糖。2015年,Howell等基于GPS荚膜的特异性靶基因设计引物,建立了GPS的PCR分型方法(H-PCR),但不能对血清5型和12型进行鉴别;2017年,Jia等基于GPS荚膜的特异性靶基因也建立了一套PCR分型方法(J-PCR),能对血清5型和12型进行了鉴别。两种PCR分型方法配合使用可对几乎所有GPS菌株分型,并从分子生物学基础上验证了其与GID和IHA方法的一致性,最终确认三种分型方法的抗原基础均为GPS荚膜。PCR分型方法具有操作简单、速度快、成本低等优点,成功解决了GID和IHA血清分型方法中的诸多问题,得到了广泛应用。本文系统回顾了GPS GID、IHA和PCR分型方法的建立与应用历史,及其相同抗原基础的发现历程,以期为GPS三种分型方法的免疫学物质基础及原理提供系统的理论知识,为副猪格拉瑟菌病防控技术的研发提供新思路。

血清14型副猪嗜血杆菌的分离与多克隆抗体制备

【目的】探明引起猪副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病发病的病原菌,并制备分离病原菌的多克隆抗体,为该病的治疗及疫苗的研发提供技术支撑。【方法】从送检病料分离出保育猪发病病原菌,并对其进行形态观察、生化鉴定与PCR鉴定,明确分离病原菌的类型及血清型;同时使用甲醛对分离病原菌进行灭活后再与弗氏佐剂乳化制备灭活菌体抗原,经肌肉和皮下免疫BALB/C小鼠,制备该分离病原菌的鼠源多克隆抗体;采用饱和硫酸铵沉淀法对制备的多克隆抗体进行纯化,利用SDS-PAGE方法鉴定纯化抗体的纯度,通过免疫荧光进一步检测抗体与抗原的结合效果。【结果】从病料中分离得到1株革兰氏阴性短小杆菌,经形态学观察、生化鉴定与PCR鉴定,分离到的病原菌为血清14型副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS);灭活后的HPS与佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠制备得到分离病原菌的多克隆抗体,阳性菌液与纯化后稀释500倍和2000倍的多克隆抗体结合并加入荧光二抗后于显微镜下观察,病原菌发出红色荧光;经Western blot检测,制备多克隆抗体在约13 ku、30 ku和50 ku处有3条清晰条带,Western blot和免疫荧光试验均证实制备的多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。【结论】制备的血清14型HPS多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。

CD 163基因敲除猪对胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌和副猪嗜血杆菌的易感性研究

旨在探究在CD 163基因的SRCR5区域插入1个碱基的CD 163基因敲除(CD 163 gene knockout,CD 163-KO)型猪对3种关键细菌的易感性相较于野生型(wild-type,WT)猪是否会有所变化,评估CD 163-KO型猪的生物安全性。本研究选用均为50日龄、体重与健康状况等相似的17头CD 163-KO型大白猪和17头WT型大白猪,其中2头CD 163-KO型大白猪和2头WT型大白猪作为空白对照,不做任何感染处理。试验猪只均无胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、猪链球菌(Streptococcus suis,SS)及副猪嗜血杆菌(Haemophlius parasuis,HPS)感染史与接种史。试验猪只随机分为3组,每组均有5头CD 163-KO型猪和WT型猪,A组接种APP1型菌株、B组接种SS2型菌株、C组接种HPS13型菌株。连续观察8 d,记录猪只临床症状表现与死亡情况;试验猪只死亡后及时解剖,观察心脏、胸腔、肺部等重要部位病变情况;采集肺样并提取肺部中的细菌DNA,用于定量PCR检测并统计分析与对比CD 163-KO型与WT型死亡大白猪肺中3种细菌分别的相对DNA拷贝量。依据试验猪只临床症状表现可得,各组试验猪只均成功感染相应的细菌,且各组内的CD 163-KO型猪与WT型猪的存活率均无显著差异(P>0.05);依据死亡猪只肺部病变情况及细菌定量PCR检测结果可得,CD 163-KO型死亡猪肺与WT型死亡猪肺中APP1型、SS2型及HPS13型菌株的相对DNA拷贝量均无显著差异(P>0.05)。本研究的结果是CD 163-KO型大白猪生物安全性的有力证据,证明CD 163基因敲除后没有提高猪只对APP、SS和HPS的易感性,不会显著影响猪只抵抗细菌的能力,为CD 163-KO型猪的生物安全性评估提供强有力的支持。

副猪嗜血杆菌4型灭活疫苗攻毒菌株的筛选

为筛选副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)4型攻毒菌株,对8株HPS进行血清型鉴定,并绘制细菌生长曲线;用豚鼠攻毒实验对其中5个菌株进行毒力测定,同时记录发病豚鼠的临床症状和剖检病变。结果显示8个菌株均为HPS4型,确定了候选菌株的最佳扩大培养时间为8~10h,筛选出毒力最强的CVCC4355。本研究确定CVCC4355可作为HPS4型疫苗产品效力检验的攻毒菌株。

1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析

【目的】阐明引起荆州某猪厂仔猪疑似副猪嗜血杆菌病的病原生理生化特性、毒力与药物敏感性,为今后对该病的防治提供科学依据。【方法】从患病仔猪中分离培养病原菌,通过形态学观察、生理生化鉴定、PCR鉴定、16S rRNA基因测序、血清型鉴定、多序列位点分型(MLST)对分离菌株进行鉴定。通过毒力基因检测、小鼠致病性、药敏试验、中药治疗试验等对分离株进行致病性、耐药性分析。【结果】通过形态学观察、生理生化试验、16S rRNA序列比对、系统进化树分析确定分离菌株为副猪嗜血杆菌。通过血清型与MLST分析确定分离菌株为血清10型、ST型为299。毒力基因检测发现,分离菌株具有CapD、vta 1、vta 2等15种毒力基因。将分离菌株腹腔注射感染小鼠,可导致小鼠多个脏器发生明显病变,具有较强致病性。耐药基因检测试验发现,分离菌株具有β-内酰胺类耐药基因bla OXA和氟喹诺酮类耐药基因gyrA。药敏试验结果显示,分离菌株对头孢他啶、新霉素、米诺环素等10种抗菌药物敏感,同时对明雄黄、款冬花、全蝎3种中药敏感。中药治疗试验结果表明,明雄黄和全蝎对分离菌株感染小鼠有较明显的治疗作用。【结论】试验成功分离1株血清10型副猪嗜血杆菌,侵染小鼠可致多个器官出血坏死,该菌株对10种抗菌药物及3种中药敏感,且明雄黄和全蝎对分离菌株感染小鼠治疗效果明显。研究结果可为今后副猪嗜血杆菌的防治和临床诊疗提供参考依据。

4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达联合验证

【目的】验证候选基因在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,GPS)感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达之间的联合调控关系,为揭示副猪嗜血杆菌引起仔猪脑膜炎的表观致病机理提供理论依据。【方法】选取6头28日龄断奶仔猪,随机均分为对照组和GPS组,GPS组仔猪腹腔注射1 mL 2×109 CFU/mL副猪嗜血杆菌SH0165菌液,对照组仔猪腹腔注射等量生理盐水,7 d后采集仔猪脑组织提取DNA和RNA。采用实时荧光定量PCR检测4个候选基因(LYPD1、PITPNM1、SYP、ACVR1B)的mRNA表达量,并利用重亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测副猪嗜血杆菌感染前后4个基因在仔猪脑组织中的DNA甲基化变化。【结果】本研究成功将MSP方法应用于基因的DNA甲基化测序研究,使其不局限于定点检测甲基化位点。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,GPS组仔猪LYPD 1、PITPNM 1、SYP、ACVR 1 B基因mRNA表达均显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01)。DNA甲基化测序结果显示,除ACVR 1 B基因外,各基因DNA甲基化均上调。【结论】除ACVR 1 B基因外,LYPD 1、PITPNM 1、SYP 3个基因DNA甲基化与mRNA表达水平呈反向关联调控,副猪嗜血杆菌感染后仔猪脑组织DNA甲基化变化对4个候选基因的表达具有不同的调控模式。

副猪嗜血杆菌致病性及免疫逃避机制研究进展

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是猪格拉泽氏病(Glasser’s disease)的病原,感染可致猪浆液纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎等病症。Hps血清型众多,不同菌株之间存在抗原异质性和致病力差异。Hps感染致病过程涉及多种毒力因子,如生物被膜、脂寡糖、荚膜、菌毛等结构物质,以及细胞致死膨胀毒素、神经酰胺酶和α-2,3-唾液酸转移酶、外膜蛋白等功能物质。多种毒力因子参与Hps对宿主细胞的黏附、入侵、定植,进而引起炎症反应,包括穿越血脑屏障引起脑炎,最终对宿主细胞和组织器官造成损伤。Hps具有多种复杂的免疫逃避机制,如突破上皮细胞屏障、降解黏膜表面sIgA、抵抗巨噬细胞吞噬和补体的杀伤作用等,从而帮助其抵御宿主免疫系统的杀伤。笔者综述了Hps不同类型毒力因子及其在致病过程中的作用,总结了Hps的免疫逃避机制研究进展,以期为该病的有效防控及新型疫苗研发提供相关新信息。

副猪嗜血杆菌病诊断分析

副猪嗜血杆菌病又名革拉斯病,属于一种急性、典型的猪传染性疾病,不同生长阶段的猪群会感染此病,其中以膘情良好、保育阶段的仔猪最为易感。副猪嗜血杆菌具有多个血清型且易产生耐药性,因此,该病在诊断、治疗方面较为困难。基于此,为避免副猪嗜血杆菌病对生猪养殖造成损失,本文结合副猪嗜血杆菌病的流行病学、临床症状、病理诊断、实验室诊断等方面进行论述,针对性提出几点高效防治方案,以期为该病的诊断与治疗提供理论建议。

副猪嗜血杆菌OmpP2基因分子特征及重组乳酸菌的构建与鉴定

猪格拉瑟病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的主要细菌性传染病。构建安全、有效的新型疫苗是防控该病的研究热点。本研究对OmpP2基因编码的蛋白质进行生物信息学预测分析后,应用无缝克隆技术把PCR扩增获得的OmpP2基因连接到pNZ8148载体,构建出pNZ8148-OmpP2重组载体,转入乳酸乳球菌感受态细胞,获得pNZ8148-OmpP2重组乳酸乳球菌;再进行蛋白表达与鉴定。结果表明:生物信息学预测到OmpP2蛋白具备优势B细胞和T细胞表位,是具有潜力的候选抗原;经重组乳酸乳球菌蛋白表达与鉴定,检测到大小约为38.5kD的目的条带,与预期大小相符。说明乳酸乳球菌能作为递送载体成功表达G.parasuis异源蛋白。本实验为后续G.parasuis乳酸菌活载体疫苗的研制奠定了基础。

副猪嗜血杆菌病的防治

副猪嗜血杆菌病也被称为格拉泽氏病或多发性纤维素性关节炎和脑膜炎,该病主要以关节炎、关节肿胀、呼吸道症状为临床表现,是生猪比较高发的一种细菌性疾病。基于此,下文笔者首先分析了副猪嗜血杆菌病的病原、临床症状、病理变化、疾病诊断,然后着重探讨了副猪嗜血杆菌病的防治措施,以期为广大生猪养殖人员提供参考。

夏季副猪嗜血杆菌病的特点及防控

夏季是副猪嗜血杆菌病的多发季节,也是猪场传染性疾病的高发期。生猪养殖中,因副猪嗜血杆菌病造成的损失极为严重。夏季高温季节,猪群养殖过程中极易出现热应激反应,影响猪群正常生长发育。副猪嗜血杆菌病又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎,也称格拉泽氏病,是由副猪嗜血杆菌引起。猪群一旦感染该病,因其发病急、传播蔓延速度较快,且致死率较高等特点,如果防治工作不及时,便会严重影响猪养殖户的正常生产和经济收益,文章首先对副猪嗜血杆菌病的特点和防控方法进行深入分析与研究,然后提出相应防控措施对其进行防控工作。

副猪嗜血杆菌病防控技术要点

副猪嗜血杆菌病是生猪养殖过程中一种常见疾病类型,疾病伴随着较强传染性,会导致生猪出现发热、贫血、皮下出血等各种临床症状,严重时还可能出现死亡病例,对养猪业发展造成了较为严重的经济损失,同时还会对公共卫生造成潜在威胁。因此,制定科学有效的副猪嗜血杆菌病防控技术显得尤为重要。基于此,文章对副猪嗜血杆菌病的防控技术要点进行了分析和探究,旨在通过探究,能够为养殖工作的科学开展起到一定参考作用。

副猪嗜血杆菌病研究进展

副猪嗜血杆菌是一种感染仔猪及保育猪的革兰氏阴性小杆菌,引发的疾病以多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎为主要特征,是猪场常见的条件致病菌。本文主要从目前中国无抗环境下副猪嗜血杆菌的耐药情况、血清型分布流行趋势及疫苗研发进展方面论述,重点介绍了耐药情况及耐药基因的检测情况,特别是多重耐药情况,为感染后的临床用药及疫苗选择提供帮助,有助于促进养猪业健康发展以及减少公共卫生安全威胁。

2022-2023年副猪嗜血杆菌病的流行情况调查分析

为了解副猪嗜血杆菌病的流行情况,从全国48家猪场采集疑似副猪嗜血杆菌感染的组织样本285份,采取荧光定量检测infB基因的检测方法,并按照样本阳性率、猪场阳性率、猪年龄、采样季节、免疫与否等进行分类分析。结果出现:81.3%猪场存在副猪嗜血杆菌感染;副猪嗜血杆菌感染在猪的不同生长阶段均十分严重;冬春季节的副猪嗜血杆菌阳性率(77.6%)显著高于夏秋季节的(55.8%);疫苗免疫场的副猪嗜血杆菌阳性率比非免疫场的低59.3%。以上结果表明,当前国内副猪嗜血杆菌病流行情况较严重,且存在明显季节性,通过接种疫苗进行预防,可有效降低副猪嗜血杆菌检出率。

规模猪场副猪嗜血杆菌病的综合防控

1概述副猪嗜血杆菌病主要病原为副猪嗜血杆菌,它作为一种常在的条件性致病菌,在受到各种应激后会表现出该病应有的临床特征,主要表现为关节炎和浆膜炎,且发病部位是多发性,特别能够引起猪只关节的疼痛与肿胀。据相关报告,该病原潜在的血清型较多,可能会造成猪只的交叉感染,给该病的预防和治疗带来极大的困难,因此,需要我们对此病原具有更加深刻而全面的了解。

猪瘟继发副猪嗜血杆菌病诊治的研究

猪瘟属于养猪行业中比较严重的急性传染病之一,其急性病例发展迅速,表现为坏血症等临床症状特征,而在慢性病例中普遍以纤维素性坏死性肠炎为主要的临床表现。另外,在近些年的临床研究中发现,副猪嗜血杆菌病很有可能在猪瘟后产生继发现象,导致实际病猪的病情状况变得更加复杂,给诊治工作带来了较大的难度,仅仅依靠临床症状和病理学检验往往难以进行有效诊断,需要对病猪予以微生物学检查。

一例猪蓝耳病和副猪嗜血杆菌病混合感染的诊治

在现代畜牧业中,猪肉产业是全球农业经济中的一个重要组成部分,为人们提供了丰富的蛋白质来源。然而,猪病的暴发和传播一直是困扰养猪业的严重问题。猪蓝耳病(Porcine Blue Ear Disease,PED)和副猪嗜血杆菌病(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是两种常见的猪病,它们分别由不同的致病微生物引起,但在一些情况下,这两种疾病可以同时感染同一头猪。