日本血吸虫副肌球蛋白全基因核酸疫苗对小鼠的抗病免疫效应

目的探讨日本血吸虫副肌球蛋白全基因核酸疫苗(Sjc97DNA)免疫小鼠诱导的抗病免疫效应。方法将40只C57BL/6小鼠随机分成4组:疫苗组,以Sjc97DNA疫苗100μg经后腿胫前肌注射免疫小鼠,共2次,间隔3周;空质粒组,以同法、同剂量的空质粒载体免疫小鼠;上述2组分别于末次免疫后3周攻击感染30±2条日本血吸虫尾蚴;感染对照组,不作免疫,感染相同数量的日本血吸虫尾蚴;空白对照组,未作任何处理。攻击感染后7周剖杀小鼠,测量肝脏单个虫卵肉芽肿大小,测定鼠血清透明质酸及层黏连蛋白含量,PCR-ELISA检测肝组织转化生长因子(TGF-β1)mRNA的表达水平。结果Sjc97DNA疫苗组小鼠肝脏虫卵肉芽肿的直径为(183.75±42.36)μm,显著小于空质粒对照组的(303.12±37.36)μm和感染对照组的(304.38±53.23)μm(P<0.01)。血清透明质酸和层黏连蛋白水平,疫苗组显著低于感染对照组(P<0.01)。肝组织TGF-β1mRNA表达水平,疫苗组亦明显低于两对照组(P<0.05)。结论Sjc97DNA核酸疫苗具有一定的抗虫卵肉芽肿及抗肝纤维化作用。

猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗的免疫保护性研究

目的 :研究猪囊尾蚴副肌球蛋白 (Ag B)核酸疫苗诱发的免疫应答。 方法 :将 pc DNA3- Ag B核酸疫苗肌注 4～ 6周龄的昆明种小鼠 ,从 2周后开始用 EL ISA方法检测小鼠体内 Ig G和 Ig G2 a的水平。另外将该核酸疫苗注射 C5 7BL / 6小鼠 ,体外培养小鼠脾细胞 ,用刀豆蛋白 A (Con A)和特异性抗原刺激 ,EL ISA试剂盒检测细胞因子 IL - 2和 IL - 4的水平 ,并观察脾淋巴细胞增殖反应。另外 ,将该核酸疫苗肌注瘦型仔猪 ,进行攻击实验 ,计算相对保护率。结果 :注射疫苗后的第 3周起 ,Ig G即为阳性 ,持续升高至第 8周 ;从第 2周起 ,小鼠血清 Ig G2 a为阳性 ,第 4周达到高峰。细胞因子检测表明 ,IL- 2水平远远高于空载体对照组 ,而 IL- 4含量却与空载体对照组无显著差异 ;实验组刺激指数明显高于空载体对照组。副肌球蛋白核酸疫苗对仔猪的相对保护率为 80 %。 结论 :猪囊尾蚴副肌球蛋白核酸疫苗在小鼠动物实验中引发了以 Th1型免疫应答占优势的全面免疫应答。pc DNA3- Ag B核酸疫苗对仔猪具有较好的免疫保护性。

日本血吸虫副肌球蛋白全基因核酸疫苗在小鼠诱生的保护性免疫力

目的： 研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白全基因核酸疫苗免疫Ｃ５７ ＢＬ／６ 及ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠诱生的保护性免疫力。方法： 将构建的日本血吸虫大陆株副肌球蛋白全基因核酸疫苗 （ｐＣＭＶ－ＳｊＣ９７） 经后腿胫前肌免疫Ｃ５７ＢＬ／６及ＢＡＬＢ／ｃ小鼠， 共免疫３ 次， 每次间隔３ ｗ ｋ。末次免疫后３ ｗ ｋ 以血吸虫尾蚴攻击感染， ６ ｗｋ 后计数成虫负荷及肝、脾、肠组织虫卵数。设不含ＳｊＣ９７ 编码基因的空载体质粒免疫组为对照组。结果： ｐＣＭＶ－ＳｊＣ９７ 免疫Ｃ５７ ＢＬ／６ 小鼠主要诱生ＩｇＧ２ａ 和ＩｇＧ２ｂ 亚类， 而免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠除诱生ＩｇＧ２ａ 和ＩｇＧ２ｂ 亚类外， 还诱生ＩｇＧ１。ｐＣＭＶ－ＳｊＣ９７ 免疫Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠诱生较明显的减虫率 （３５．５％ ～４１．１％ ） 和减卵率 （肝、脾及肠组织减卵率分别为４４．５％ ～５９．６％ 、５６．７％ ～８２．４％ 及５７．９％ ）， 而对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠未诱生保护性。结论： ｐＣＭＶ－ＳｊＣ９７ 核酸疫苗能对Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠诱生较明显保护性免疫力， 而对ＢＡＬＢ／ｃ

日本血吸虫副肌球蛋白全基因克隆、测序及体内表达

目的： 将日本血吸虫大陆株副肌球蛋白（ Ｓｊｃ９７） 编码区全基因克隆及测序， 并研究 Ｓｊｃ９７ 全基因核酸疫苗在小鼠体内的表达。方法： 抽提日本血吸虫成虫总 Ｒ Ｎ Ａ， 逆转录聚合酶链反应 （ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ） 扩增编码 Ｓｊｃ９７的全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ， 双脱氧链末端终止法测 Ｄ Ｎ Ａ 序列。构建含 Ｓｊｃ９７ 全基因的质粒表达载体 （ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７） ， 并用免疫荧光染色法研究ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 在小鼠体内的表达特性。结果与结论： 用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增获得了 Ｓｊｃ９７ 的编码区全基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ， 并测定了该基因编码区的全序列。与日本血吸虫菲律宾株、日本株及曼氏血吸虫副肌球蛋白编码区全基因比较， 核苷酸序列同源性分别为： ９９４ ％ 、９９２ ％ 和９１０ ％ ； 推导的氨基酸序列同源性分别为：９９７ ％ 、９９８ ％ 和９６０ ％ 。ｐ Ｃ Ｍ Ｖ Ｓｊｃ９７ 核酸疫苗能在注射的小鼠局部肌肉组织表达 Ｓｊｃ９７ 。

日本血吸虫副肌球蛋白小鼠免疫试验

应用生物化学方法从日本血吸虫成虫中提取虫体副肌球蛋白,并把它结合佐剂FCA/FIA或BCG免疫两批BALB/c小鼠,获得了32.18%—48.52%的减虫率,但统计学上大都无显著差异.两次实验结果还表明,应用虫体副肌球蛋白结合FCA/FIA进行肌肉注射,和应用等量抗原结合BCG皮内注射免疫的BALB/c小鼠,获得的减虫率相当.

猪囊尾蚴副肌球蛋白cDNA中CpG序列的免疫激活作用

目的 探讨猪囊尾蚴副肌球蛋白 (又称为AntigenB ,AgB)cDNA中CpG序列的免疫激活作用。 方法 以pcDNA3 AgB质粒疫苗、CpG序列突变的pcDNA3 AgB′质粒疫苗、pcDNA3载体质粒和AgB蛋白质分别免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,2wk后开始用ELISA检测小鼠血清中IgG和IgG2a的效价。 结果 免疫接种的第 2周起实验组IgG与IgG2a效价开始升高 ,至第 4周达到峰值。其中以pcDNA3 AgB组升高最为显著 (P <0 0 5 )。 结论 pcDNA3 AgB核酸疫苗所诱导的小鼠免疫反应 ,不仅具有其表达产物AgB蛋白的抗原作用 ,AgBcDNA中的CpG序列也具有免疫激活作用。

周期型马来丝虫副肌球蛋白基因真核表达重组质粒构建

提取周期型马来丝虫总RNA。跟据已知的马来丝虫副肌球蛋白(BmPmy)基因序列,设计合成引物,并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,应用RT-PCR技术,扩增BmPmy基因片段,克隆至载体pGEM-T中,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-BmPmy,并转染COS-7细胞后进行RT-PCR分析。转染的COS-7细胞高水平表达周期型马来丝虫副肌球蛋白mRNA,结果与预期相符。

日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定

目的鉴定日本血吸虫副肌球蛋白的T细胞表位。方法用SYFPEITHI软件预测日本血吸虫(中国大陆株)副肌球蛋白的T细胞表位,候选表位分别命名为P20、P21、P22、P23、P24。设计并合成候选表位的编码核苷酸,定向克隆入融合表达载体pET-32c(+),经酶切及测序鉴定出重组克隆。阳性克隆经IPTG诱导表达,表达产物以Ni2+-NTA柱亲和层析及透析纯化。纯化后的硫氧还蛋白(Trx)融合蛋白体外刺激C3H/HeJ及C57BL/6小鼠腹股沟淋巴结或脾脏单个核细胞,3H-TdR掺入法检测其增殖。结果候选表位中P20、P21、P22、P23能有效刺激C3H鼠致敏淋巴细胞细胞增殖,P20、P22能刺激C57鼠致敏淋巴细胞增殖。结论P20和P22可能是日本血吸虫副肌球蛋白的通用性T细胞表位。

家蚕副肌球蛋白/小副肌球蛋白基因的克隆及进化分析

[目的]克隆家蚕副肌球蛋白/小副肌球蛋白基因,分析该基因与运动性状的关系。[方法]利用PCR扩增和RACE技术获得了家蚕(Bombyxmori)副肌球蛋白的全长cDNA和小副肌球蛋白的部分cDNA;经检索家蚕wgs(基因组散弹序列)数据,获得了家蚕副肌球蛋白/小副肌球蛋白的基因组序列,并确定其基因组结构。[结果]家蚕PM/mPM基因由17个外显子和16个内含子组成,通过基因内部选择性启动子的使用,该基因组序列同时编码副肌球蛋白和小副肌球蛋白,小副肌球蛋白和副肌球蛋白共用最后6个外显子。家蚕副肌球蛋白与其他无脊椎动物副肌球蛋白的聚类分析表明,家蚕和野桑蚕有最近的亲缘关系,在昆虫纲中与黑腹果蝇关系最远。[结论]家蚕和野桑蚕副肌球蛋白的氨基酸序列间不存在可引起飞行缺陷的点突变,推测家蚕和野桑蚕飞行能力差异存在其他调控机制。

兔疥螨副肌球蛋白基因的RT-PCR扩增克隆与序列分析

在首次建立兔疥螨人工感染增殖以及分离纯化方法的基础上,参考GeneBank中登录的红狐疥螨副肌球蛋白基因序列(AF462195)以及人疥螨副肌球蛋白部分基因序列(AF317670)所设计的特异性引物,首次用RT-PCR方法直接扩增出了兔疥螨副肌球蛋白部分基因(登录号为DQ131648).序列分析表明:兔疥螨与红狐疥螨及人疥螨副肌球蛋白的序列相似性分别为99.3%和99.4%,推导氨基酸序列的相似性分别为99.5%和100%.进化树分析可知,3者在亲缘关系上极为相近,而兔疥螨与人疥螨则更为接近.

重组日本血吸虫副肌球蛋白诱导水牛保护性免疫的研究

为观察重组日本血吸虫副肌球蛋白 (r Sj97)对水牛的保护效果。 2 0头水牛随机分为佐剂 (Quil A)对照组和抗原 (r Sj97)免疫组。对照组仅注射 Quil A,而免疫组注射 Quil A加 r Sj97,在第 0、2、15周肌肉注射。第 3次免疫后两周经腹部贴片攻击感染 10 0 0条日本血吸虫尾蚴 ,感染后第 49d剖杀冲虫 ,计数虫数和肝卵数。结果显示 ,与对照组相比 ,r Sj97免疫组的减虫率为 49.9% (P<0 .0 5 ) ,肝脏减卵率 5 7.3% (P<0 .0 1)。提示 r Sj97可诱导水牛产生一定程度的抗血吸虫攻击感染的保护性免疫力 ,并具有一定程度的抗病作用 ,进一步证实了副肌球蛋白可作为抗血吸虫病的候选疫苗分子。

家蚕副肌球蛋白/小副肌球蛋白基因的克隆及进化分析

1材料与方法1．1材料家蚕为该实验室保存的“大造”品系，25℃桑叶育，羽化后2h内收集家蚕蛾于-70℃保存备用。1．

日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因克隆

目的 :克隆日本血吸虫大陆株副肌球蛋白部分基因。方法 :用 PCR方法根据已发表日本血吸虫菲律宾株副肌球蛋白基因部分核苷酸序列扩增大陆株副肌球蛋白基因。结果 :获得一日本血吸虫大陆株 72 0 bp基因克隆。结论 :经核苷酸序列分析证实 ,本克隆基因与菲律宾株基因核苷酸同源性为 99.0 3%。

编码中国大陆株日本血吸虫副肌球蛋白C端蛋白基因的克隆和表达

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从中国大陆株日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库中扩增到一编码血吸虫副肌球蛋白Ｃ端蛋白的ＤＮＡ克隆，并把该ＤＮＡ进一步亚克隆到ｐＴｒｃＨｉｓＡ载体上进行表达。表达产物的分子量为３３ｋｕ，它和纯化的中国大陆株日本血吸虫成虫副肌球蛋白一样，都能被抗曼氏血吸虫副肌球蛋白的单克隆抗体所识别。说明该重组抗原具有血吸虫副肌球蛋白的抗原性。

重组日本血吸虫副肌球蛋白诱导小鼠保护力的研究

目的 用重组日本血吸虫副肌球蛋白 (r Sj97)免疫小鼠 ,观察保护效果。方法 小鼠随机分为 3组 ,免疫组在 0、2、15周 ,皮下注射 r Sj97加佐剂 Quil A ,同一时间佐剂对照组和空白对照组注射等量 Quil A和缓冲液 A,第 3次免疫后 2周 ,每鼠经腹部贴片攻击感染 5 0条尾蚴 ,感染后 45 d剖杀小鼠 ,观察其减虫和减卵效果。结果 与缓冲液和 Quil A对照组相比 ,r Sj97+Quil A免疫组的减虫率分别为 44 .1% (P<0 .0 1)和 17.8% (P<0 .0 5 ) ,每克肝组织虫卵数 (L EPG)减少率分别为76 .5 % (P<0 .0 1)和 16 .9% (P<0 .0 5 ) ,每雌肝组织虫卵数 (L EPF)减少率分别为 6 2 .2 % (P<0 .0 1)和 6 .1% (P<0 .0 5 )。结论 r Sj97加佐剂 Quil

重组日本血吸虫副肌球蛋白的表达与纯化

用基因重组技术 ,将日本血吸虫副肌球蛋白 (rSj97)基因亚克隆至表达载体pQE30上。在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫副肌球蛋白在大肠杆菌中得以高效表达。通过快速蛋白质液相色谱仪 (FPLC) ,经TALON柱和离子交换柱两步分离纯化 ,获得大量高纯度的重组日本血吸虫副肌球蛋白 。

曼氏和日本血吸虫副肌球蛋白的抗原肽研究

副肌球蛋白是世界卫生组织选取的用来发展血吸虫疫苗的重要候选蛋白之一 .在计算机辅助下 ,应用PC Gene程序 ,根据曼氏和日本血吸虫副肌球蛋白的氨基酸序列 ,通过对其亲水性、柔韧性、可接近性和二级结构分析预测出 8个抗原肽 ,并用固相法进行了合成 .经Dot ELISA法测定 ,其中的 2个对抗日本血吸虫免疫球蛋白多克隆抗体 (抗 Sj IgG PcAb)显示出抗原性 。