一株鸽副黏病毒Ⅰ型分离鉴定及致病性分析

在天津的病死鸽病料中分离鉴定鸽副黏病毒Ⅰ型(pigeon paramyxovirus-1,PPMV-1),并对其进行遗传演化、生物学特性、致病性分析,为鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗的研发提供科学依据。采用RT-PCR方法进行病原检测,在SPF鸡胚上分离纯化病毒;经遗传演化分析、致病性分析及动物回归试验对病毒分离株进行全面分析。结果显示:病死鸽的脏器样品经RT-PCR鉴定为NDV核酸阳性;鸡胚分离纯化后得到1株鸽副黏病毒Ⅰ型毒株,命名为Pigeon/TJ/CH/020/2020(TJ20)。通过对病毒F基因测序及进化树分析,确定该分离毒株属于ClassⅡ类Ⅵ.2.1.1.2.2(原Ⅵk)基因亚型,裂解位点的氨基酸残基为112 R-R-Q-K-R-F^(117),符合NDV强毒株的分子特征。交叉血凝抑制试验显示TJ20株与LaSota疫苗株存在明显的抗原性差异。TJ20株的鸡胚半数感染量(EID_(50))为10^(-8.38)·0.1 mL^(-1)、细胞半数感染量(TCID_(50))为10^(-8.64)·0.1 mL^(-1)、鸡胚平均致死时间(MDT)为62 h、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.19。动物感染试验结果表明,1月龄鸽人工感染TJ20株后第4天开始出现嗜睡、垂翅、腹泻、瘫痪、斜颈扭头等新城疫典型临床症状,发病率和死亡率均为100%。本研究从病死鸽组织中成功分离出一株具有高致病性的Ⅵ.2.1.1.2.2(原Ⅵk)基因亚型的TJ20毒株,为后续鸽副黏病毒Ⅰ型疫苗研发提供了重要的生物学材料。

鸽副黏病毒Ⅰ型S-1株的分子特性分析

对从上海郊区发病鸽场分离鉴定的鸽副黏病毒Ⅰ型S-1毒株进行分子特性分析,选取融合蛋白F基因片段设计特异性引物,用RT-PCR扩增F基因cDNA片段,并将其克隆到pGEM-T载体中。序列分析结果表明,分离株的F基因片段为1666 bp,包含完整的F基因,编码553个氨基酸,其F蛋白与常见疫苗株B1、La Sota、V4的氨基酸同源性分别为89.2%、89.0%和91.5%;与国内鸽分离株YN P1、ch 98-1和STP96的氨基酸同源性分别为91.2%、93.9%和94.6%;与国外鸽分离株116600、248VB、Capital 397、IT-22782和Tigre 699的同源性分别为95.7%、96.0%、95.1%、99.1%和95.5%。PPMVS-1分离株的F蛋白裂解位点序列为112G-R-Q-K-R-F117,属于基因Ⅵ型中等毒力的鸽Ⅰ型副黏病毒。

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的田间试验

为验证鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)对鸽子的安全性和免疫效果,对试制的5批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)分别在3家规模化养鸽场进行田间试验。结果表明:幼龄鸽、青年鸽和种鸽免疫鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)后均无任何不良反应,并产生了较高的抗体水平,免疫后180 d对鸽副黏病毒Ⅰ型强毒川沙株的攻毒保护率在90%以上。试验效果证明,鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)安全有效。

鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)的分离与鉴定

利用SPF鸡胚培养法从上海川沙某具有典型新城疫症状和病理变化的高死亡率发病鸽场的死亡鸽体内分离到一株病毒。对该病毒E5代尿囊液进行病原学鉴定、RT-PCR鉴定、理化特性测定、致病指数、病毒血清学试验及鸽体致病性试验,结果显示该病毒具有血凝性,且血凝特性可被新城疫病毒参考阳性血清所抑制,而不能被减蛋综合征病毒、禽流感病毒(H5、H9和H7)阳性血清抑制;该病毒对氯仿、乙醚和酸敏感;致病指数分别为:最小致死量鸡胚平均死亡时间为55.2 h,1日龄雏鸡脑内致病指数为1.8,6周龄雏鸡静脉致病指数为2.39。经鉴定,该分离毒株为鸽副黏病毒Ⅰ型强毒株,将其命名为鸽副黏病毒Ⅰ型(川沙株)。

鸽副黏病毒Ⅰ型(S-1株)的分离与鉴定

利用SPF鸡胚培养的方法对上海郊区疑似发生鸽副黏病毒Ⅰ型感染的鸽场病料进行病毒分离,病料上清液在10～11日龄SPF鸡胚上盲传5代,鸡胚死亡时间趋于规律性,鸡胚在接种72h内死亡90%以上,死亡胚全身出血;通过对病毒液进行病原学鉴定(该病毒液具有HA,这种血凝性可被NDV参考阳性血清抑制,而不能被EDSV、AIV-H5、AIV-H9、AIV-H7阳性血清抑制)、致病指数(采用SPF鸡胚和SPF鸡测定致病指数分别为MDT=64.8h、ICPI=1.3625、IVPI=0.75)及鸽体致病性等试验,初步鉴定为鸽副黏病毒Ⅰ型中等毒力毒株,命名为鸽副黏病毒Ⅰ型(S-1株)。

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)灭活与乳化工艺的研究

本研究以不同浓度的甲醛溶液在不同温度下采用不同时间灭活鸽副黏病毒Ⅰ型(S-1株)病毒液,通过测定灭活效果及其灭活后对抗体阴性鸽的安全性,最终确定甲醛溶液的加入浓度为0.2%,灭活温度为37℃,灭活时间为24 h。通过测定不同水油比乳化获得的鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的稳定性,确定该疫苗的水油乳化比为1∶4。

鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)免疫途径研究

为了确定鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)的适宜免疫途径,采用3批鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)实验室制品分别以肌肉注射、皮下注射两种途径免疫30 d低抗体幼龄鸽(HI抗体≤2)和120 d低抗体青年鸽(HI抗体≤2),观察试验鸽的精神状况和疫苗的局部吸收情况,每2周对试验鸽进行一次采血,测定HI抗体,直至免疫后20周,分析两种免疫途径免疫试验鸽的临床症状和产生的抗体差异。结果表明:两种免疫途径免疫的试验鸽均无全身及局部不良反应,免疫后2周抗体在4.0 log2以上,两种免疫途径免疫抗体差异不显著(HI抗体差异在0.2 log2以内)。因此,在鸽副黏病毒Ⅰ型灭活疫苗(S-1株)制造及检验试行规程中规定:该疫苗的免疫途径为肌肉注射或皮下注射。

鸽Ⅰ型副黏病毒、圆环病毒和疱疹病毒混合感染的诊断

研究旨在确诊广西某肉鸽场中出现神经症状的病鸽并为该场提供相应的防治方案,通过临床诊断、病理解剖、分子生物学检测、细菌分离、病毒分离等方法对广西某肉鸽场病鸽进行诊断。结果显示,剖检可见病鸽肝脾肿大、坏死,花斑肾;分子生物学检测结果显示,鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type 1,PPMV-1)、圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)和疱疹病毒(pigeon herpesvirus,PiHV)为阳性;对病样进行细菌培养,结果未分离到细菌;将病样接种SPF鸡胚进行病毒分离,结果显示,尿囊液血凝效价稳定在8 log2,其血凝性可被新城疫病毒(NDV)阳性血清抑制,但不能被禽流感病毒(AIV)阳性血清抑制。研究表明,最终诊断结果为PPMV-1、PiCV和PiHV混合感染。

1株鸽Ⅰ型副黏病毒的分离与鉴定

本试验采集病死鸽临床样品,用SPF鸡胚接种传代分离病毒后,通过血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、RT-PCR及F基因部分片段测序与分析对分离株进行鉴定,并通过测定鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和动物回归试验评估分离株的毒力和致病性。结果表明,从病鸽组织病料中分离获得1株鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1),命名为GXP120012。分离株GXP120012的F基因裂解位点112-117位的氨基酸组成为R-R-Q-K-R-F,符合强毒株特征;GXP120012与PPMV-1参考毒株pi/CH/LLN/110713的核苷酸序列同源性高达98.9%,并处于同一遗传分支,基因型为Ⅵ型。该分离株的MDT为102h,ICPI为0。动物回归试验发现,分离株GXP120012对鸽具有较强的致病性,而对鸡没有致病力。本试验结果为今后鸽新城疫的分子流行病学研究和疾病防控提供理论依据。

鸽Ⅰ型副黏病毒与沙门氏菌、大肠杆菌混合感染的诊断

从珠三角某鸽场病死鸽中无菌操作采取心血、肝脏、脑、脾脏,接种于麦氏培养基和木糖—赖氨酸—脱氧胆酸琼脂培养基,经细菌纯化、镜检、生化试验、PCR检测和药敏试验,结果显示30只病鸽有8只分离到沙门氏菌,阳性率为26.7%;10只分离到大肠杆菌,阳性率为33.3%;其中6只同时分离到沙门氏菌和大肠杆菌,混合感染率为20.0%。经病毒分离培养、PCR检测,结果显示从6个混合样品中分离到5株副黏病毒,分离率为83.3%。结果表明,该鸽场鸽群发生了副黏病毒、沙门氏菌、大肠杆菌混合感染。本试验对珠三角鸽场近年较常发生的、以乳鸽较严重发病死亡的典型疫情作了较明确的诊断。

广东地区鸽禽Ⅰ型副黏病毒分离株生物学特性研究

鸽禽Ⅰ型副黏病毒（Avian Paramyxovirus TypeⅠ，PA／PMV—Ⅰ）感染，因其病原及症状均与鸡新城疫（ND）十分相似，通常又称之为鸽新城疫，或鸽瘟，是鸽的一种急性烈性传染病。近年来我们从广东的深圳、东莞、广州市郊等地区发病鸽群中分离并鉴定到23株禽Ⅰ型副黏病毒，对其中6株病毒进行生物学特性研究。

鸽源Ⅰ型禽副黏病毒HN基因序列测定和分析

以分离自云南省的一株鸽源禽I型副黏病毒YN-P1株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出HN基因片段,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后,对阳性克隆进行核苷酸序列测定。测序后拼接得出HN基因的全序列。测序结果显示,YNP1毒株HN基因为1 716 nt。通过与参考毒株比较HN基因序列,发现所研究毒株YN-P1与TW95核苷酸序列同源性最高为88.3％;与ZJ1／Go氨基酸序列同源性最高为91.6％。

太子参须对禽Ⅰ型副黏病毒疫苗的增强作用

为了探讨不同剂型太子参须对禽I型副黏病毒灭活疫苗免疫效果的影响,本试验将240只4日龄雏番鸭随机分成3个太子参须试验组(太子参须针剂组、太子参须颗粒组、太子参须提取干粉组)和未给药免疫组,除未给药免疫组外,其他组按每天每只鸭0.5 mL或0.5 g口服给药,连用7 d。7日龄时,各组番鸭均颈背部皮下注射禽I型副黏病毒灭活疫苗,于不同时间点进行体重测定、抗体检测、免疫器官指数测定。结果显示,与未给药免疫组相比,各太子参须试验组免疫21 d后的体重显著升高(P<0.05),且太子参须提取干粉组至免疫后35 d仍最优;免疫后14、21、28 d和35 d,太子参须提取干粉组的抗体水平显著提升(P<0.05);免疫后5 d和7 d,各太子参须试验组番鸭平均胸腺指数显著增高(P<0.05),至免疫后21 d,太子参须针剂组番鸭平均胸腺指数仍显著增高(P<0.05);免疫后5、7、14 d和21 d,太子参须提取干粉组番鸭的平均脾脏指数和平均法氏囊指数均显著增高(P<0.05)。结果表明,太子参须提取干粉组对禽I型副黏病毒番鸭体重、抗体水平、免疫器官指数有显著促进作用。本试验为太子参须制剂对禽I型副黏病毒疫苗的增强效果和临床应用提供参考依据。

一株鸭源禽Ⅰ型副黏病毒毒力测定及诱导免疫应答研究

试验旨在测定一株从番鸭中分离获得的禽Ⅰ型副黏病毒(GSFY株)的生物学特性和遗传特性,并将其制成油乳剂灭活疫苗,进行番鸭免疫保护试验。结果显示,GSFY株的平均致死时间(mean death time,MDT)为71h,脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)为1.75,静脉接种致病指数(intravenous pathogenicity index,IVPI)为2.49;GSFY株F基因核苷酸序列同源性分析显示,其与鸡源Chicken/China/Guangxi 9/2003株同源性最高,为97.1%,且二者均处于基因Ⅶ型分支,综合以上结果确定其为禽Ⅰ型副黏病毒基因Ⅶ型强毒株。免疫保护试验结果显示,疫苗进行3次免疫后对番鸭有良好的免疫保护效果,3次免疫后第7天抗体效价平均值达到6log2,第21天抗体效价平均值达到8log2,用GSFY毒株攻击免疫番鸭,当抗体滴度>5log2时,保护率达100%。本研究结果为生产实践制订鸭预防禽Ⅰ型副黏病毒病的免疫程序提供参考。

不同禽源的禽Ⅰ型副黏病毒株毒力、免疫原性及抗原相关性研究

从病死的鸡、鹅、鸽中分离到3株禽I型副黏病毒(CPMV、GPMV、PPMV)。毒力测定结果显示,CPMV、GPMV的毒力与鸡新城疫病毒(NDV)F48E9株的毒力相似,为强毒型;PPMV的毒力与鸡NDVLaSota株的毒力相似,为自然弱毒株。对该分离株F基因裂解位点的序列分析结果表明,CPMV、GPMVF裂解位点氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的序列特征;PPMV F裂解位点氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,属于弱毒株的特征性序列。将该3株病毒制成灭活疫苗,分别免疫鸡,结果都能诱导鸡体产生较高水平的HI抗体;再分别以CPMV、GPMV攻击免疫鸡群,结果显示免疫鸡群可得到保护,而非免疫鸡群被攻击后全部致死。用HI方法检测3株病毒与Lasota株之间的交叉血凝抑制试验,结果表明LaSota与GPMV两毒株间的抗原性无明显差异,LaSota与CPMV、PPMV两毒株间的抗原性有较小的差异。本研究将有助于进一步开展禽Ⅰ型副黏病毒的致病机制和新型疫苗等方面的研究。

鹅Ⅰ型禽副黏病毒F基因重组质粒的构建及其DNA免疫

通过RT PCR扩增出鹅Ⅰ型禽副黏病毒GPMV/QY97 1株F蛋白基因的cDNA ,并将F基因cDNA克隆到含CMV启动子的pCI载体上 ,构建这一基因的真核表达质粒pC GPMVF ,以此质粒肌肉注射 3周龄非免疫鸡 ,并分别于免疫后第 2、4、6周通过ELISA方法检测抗体水平。结果证明 ,用重组质粒pC GPMVF免疫鸡 。

一株鸽源Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定和F基因序列分析

为了研究山西地区鸽源Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)的遗传进化规律,试验通过采集疑似病鸽临床病料,经SPF鸡胚传代分离病毒,采用血凝试验和RT-PCR对分离株进行鉴定,扩增分离株F基因部分片段进行同源性分析,并通过病毒毒力测定试验和动物回归试验评价分离株的毒力和致病性。结果表明:从发病鸽群中分离鉴定1株PPMV-1,命名为PPMV-1-SX-011,分离株F基因裂解位点氨基酸序列为^(112)RRQKRF^(117),具有新城疫病毒(NDV)强毒株的典型分子特征;分离株PPMV-1-SX-011与国内流行株Pi/CH/LN/2017、Pi/SH/CH/0168/2013、Pigeon/China/BJ2013、pigeon/China/SDS/2011在遗传进化树上处于同一分支,其中与Pi/SH/CH/0168/2013、pigeon/China/SDS/2011的核苷酸序列同源性高达98.1%和97.7%,属于ClassⅡ基因Ⅵb型;但是与经典疫苗株La Sota、B1、Clone30和Mukteswar株的同源性仅为82.7%~84.5%。分离株PPMV-1-SX-011最小致死量致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)值分别为105.6 h、0.3和0。分离株能引起试验鸡和试验鸽体内的免疫应答反应;对试验鸽的致病力强,而对试验鸡无致病力,表明分离株对鸽有特殊亲嗜性。说明本研究分离得到一株鸽源PPMV-1,其具有NDV强毒株裂解位点,对鸡的致病力却与传统NDV存在明显差异,提示山西地区存在对鸽具有强致病性的NDV弱毒株的基因变异株。