肿瘤抑制基因p53的结构与功能保守性的比较分析

目的 比较分析不同物种来源的p5 3蛋白的系统发育规律及其结构与功能的保守性。方法 多序列比较、结构域比对和二级结构预测等生物信息学分析及系统发生树构建。结果 模式生物间p5 3蛋白有较高同源性 ,而且都具有p5 3蛋白的典型结构特征 ;各结构域中维持功能活性必需的氨基酸残基几乎不变 ,二级结构折叠元件的组成和分布也十分类似 ;最大似然法和邻接法两种方法推导出的分子系统进化树基本一致。结论 物种来源不同的p5 3蛋白同属于一个有相似功能作用的蛋白家族。从比较生物学新的角度 ,进一步说明了p5 3蛋白的结构和功能保守性。

细菌和人短型tRNase Z^S与粟酒裂殖酵母长型tRNase Z^L功能保守性研究

tRNase Z是一种参与tRNA前体3'末端加工的核酸内切酶,根据氨基酸残基数目分为长型(tRNase ZL)和短型(tRNase ZS)两类.细菌只有短型,而真核生物既可以有短型也可以有长型,并且绝大部分真核生物只有一个长型.为了研究短型tRNase Z和长型tRNase Z的功能保守性,分别构建表达编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)短型tRNase Z(BsuTrz1)、人短型tRNase Z(ELAC1)以及海栖热袍菌(Thermotoga maritima)短型tRNase Z(TmaTrz1)的酵母低表达载体,并转化tRNase ZL温敏型粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)进行互补救活实验.结果显示,与粟酒裂殖酵母tRNase ZL(SpTrz1)相比,ELAC1能在37℃完全救活酵母tRNase ZL温敏型菌株,而BsuTrz1的救活能力略弱.但具有不同底物特异性的TmaTrz1则完全不能救活.此外,催化活性受损的ELAC1组氨酸模体突变体(ELAC1-H62A和ELAC1-H64A)救活酵母tRNase ZL温敏型菌株的能力极大受损.这些结果表明,枯草芽孢杆菌和人的tRNase ZS能替代粟酒裂殖酵母的tRNase ZL,并且这些蛋白具有功能保守性.这些实验进一步支持了长型tRNase Z基因是由短型tRNase Z基因复制后序列进化形成的观点.

极性蛋白Crumbs胞内域功能保守性研究

跨膜蛋白Crumbs(Crb)是细胞顶部的决定因子,对上皮细胞顶?底极性的建立和维持起着关键的作用。其胞内域虽然仅有37个氨基酸,但对Crb的功能必不可少。在果蝇(Drosophila melanogaster)中,如果胞内域发生突变,将造成胚胎发育异常、上皮细胞顶底极性丧失等严重后果。Crb胞内域从果蝇到小鼠(Mus musculus)和人类(Homo sapiens)具有很高的同源性,但线虫(Caenorhabditis elegans)两个Crb蛋白的胞内域与果蝇和哺乳动物却较为不同。为验证线虫Crb蛋白胞内域是否功能保守,本文利用基因组工程法(Genomic engineering),将果蝇基因组中Crb基因编码胞内域的部分替换为一致性和相似性较远的线虫Crb2基因的相应区段。与其他Crb胞内域突变果蝇不同,替换突变体胚胎发育正常,Crb及其他极性蛋白的表达和定位正常,胚胎上皮细胞顶底极性能够正确的建立和维持。这些结果证实虽然线虫和果蝇Crb蛋白胞内域之间存在大量序列变异,但重要的氨基酸位点和功能模块则完全保守。

野猪DHX36解旋酶酶学特性及保守性分析

DHX36解旋酶(DEAH-box helicase 36)在生物体内广泛存在,可作为外源核酸传感器广泛参与机体免疫反应,因其对G-四链体具有高度亲和性和解旋活性而备受关注。目前已报道了3个物种DHX36解旋酶的三维结构,但其酶学活性的保守性研究鲜见报道。本文以哺乳动物野猪(Sus scrofa)DHX36解旋酶(SsDHX36)为研究对象,通过生物化学与生物物理研究技术系统研究了其酶学性质,并对比其与低等无脊椎动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)DHX36解旋酶(DmDHX36)的活性,探究DHX36在物种间的功能保守性。本研究通过原核表达系统,分离纯化得到了纯度大于95%的SsDHX36解旋酶;利用荧光偏振和快速停留技术得到SsDHX36的最佳酶学反应条件,发现SsDHX36对G4 DNA具有平行构型的亲和选择性,对富含鸟嘌呤的ssDNA具有结合和解旋的底物偏好性;结合单分子荧光共振能量转移技术对SsDHX36和DmDHX36进行活性比较,发现两者与G4 DNA结合的构型选择性和对富含鸟嘌呤DNA的底物偏好性是保守的。但两者对不同序列长度ssDNA的亲和性差异显著,SsDHX36受序列长度影响较大且亲和力随序列长度的增加而增强,而DmDHX36则完全相反。本文克隆纯化了SsDHX36解旋酶并研究了其酶学活性,着重分析了SsDHX36和DmDHX36的功能保守性,为理解DHX36的保守功能机制,探究基于DHX36与富含鸟嘌呤序列互作的免疫反应酶学活性基础和靶向药物设计提供了理论与实验基础。