基因狩猎:功能克隆、定位克隆和表型克隆

致病基因的成功分离使人类能够深入洞察遗传性疾病的发病机理,并能对其进行科学的诊断和防治,同时也直接促进了生物高技术的进步,因此,它是现代遗传学最激动人心的领域.本文论述了基因克隆的发展历程和三种主要策略即功能克隆、定位克隆和表型克隆及其基本原理和重要成就,并展望了发展趋势.随着人类基因组计划的进展,定位克隆的一个新版本——定位候选基因技术正成为基因克隆的一种快捷高效的策略;表型克隆具有高度覆盖面和解析力,对复杂遗传病相关基因的围猎有独特的价值.

功能差异细胞模型筛选抗肺癌功能性单克隆抗体及其抗原

目的:筛选获取抗肺癌细胞膜的功能性单克隆抗体及其靶抗原,为肺癌靶向治疗提供候选治疗剂及靶标。方法:将新鲜人肺癌组织细胞免疫BALB/c小鼠,采用脾细胞融合法制备大容量单克隆抗体库。建立肺癌细胞增殖、侵袭、迁移等定向功能差异细胞模型,采用活细胞免疫荧光与功能差异模型筛选其抗原在定向功能(细胞增殖、迁移、侵袭)差异模型细胞膜上差异表达的单抗,再经体外相应功能实验筛选具有抑制作用的功能性单抗,Western blotting鉴定这些单抗的抗原,裸鼠体内抑瘤实验鉴定部分单抗对肺癌的抑制作用。结果:细胞融合后共获得2 893株杂交瘤克隆,其中与肺癌细胞膜结合反应的309株。分别建立了3种体外肺癌细胞增殖、侵袭、迁移差异模型用于筛选,筛选获得20株单抗能显著抑制肺癌细胞增殖、10株单抗能显著抑制肺癌细胞侵袭、5株单抗能显著抑制肺癌细胞迁移(P<0.05或P<0.01)。Western blotting鉴定了其中6株的抗原。选取其中2株单抗均能在裸鼠体内显著抑制肺癌移植瘤的生长(P<0.05或P<0.01)。结论:采用大容量功能性单抗库技术结合功能差异细胞模型可批量筛选获得具有体内外抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性单抗,为筛选肺癌靶向治疗剂及靶标提供了一种潜在的新方法。

细胞内分布克隆——一种新的功能性基因克隆方法

明确蛋白质的细胞内定位对了解蛋白质的功能有很强的提示作用。近年来随着对蛋白质细胞内定位信号和转运机理的深入了解,建立了根据蛋白质分子在细胞内的特殊定位进行快速功能性基因克隆的方法,即细胞内分布克隆。其筛选基础可以是形态学的,也可以是功能上的。利用这些方法克隆了许多定位于特定细胞器但功能未知的蛋白基因。本文对这些方法及其进展进行综述。

重组人源化双功能单克隆抗体致细胞因子释放综合征1例

双特异性抗体现已成为肿瘤免疫治疗药物的热点,而其诱发的与免疫相关的细胞因子释放综合征(CRS)可能危及生命,已成为当前关注的焦点。我院Ⅰ期临床试验1例乳腺癌患者,首次输注重组人源化双功能单克隆抗体MBS301在11 min后出现胸闷、气急渐加重、周身湿冷、血氧下降等症状,考虑为CRS。予以甲泼尼龙琥珀酸钠抗炎,哌拉西林钠舒巴坦钠及利奈唑胺抗感染、化痰等对症治疗,患者症状好转。及时应用糖皮质激素可以治疗双特异性单克隆抗体引起的CRS。

植物基因克隆的策略和方法

本文介绍了功能克隆，定位克隆，表型克隆等９种克隆植物基因的方法，着重分析了每项克隆方法的工作原理。

植物基因克隆的策略和方法

植物基因克隆是当前植物学研究的前沿和热点。经过近 2 0年的发展 ,已经形成了一些克隆植物基因的方法 ,主要有功能克隆 ,PCR扩增 ,转座子或T DNA标签 ,定位克隆 ,差别杂交和减法杂交 ,mRNA差异显示和人工合成克隆。本文对这些技术的工作原理 。

利用多路选择器熵源的高移植性轻量级物理不可克隆函数研究

SR锁存器物理不可克隆函数(Physical Unclonable Function, PUF)是基于FPGA实现的最流行加密应用,在轻量级物联网设备中拥有广阔的市场。为了实现对称无偏SR锁存PUF,研究人员提出了不同的实现方法,这些方法增加了面积消耗。该文提出一种新型的基于MUX单元的延迟门来构成M_SR PUF单元,并将稳定状态下SR锁存器的输出提取作为PUF的响应。为了验证所提出的M_SR PUF,该文在Xilinx Virtex-6,Virtex-7和Kintex-7 3个系列的FPGA上进行了实现。值得一提的是,对称布局通过“硬宏”实现相对简单,保证了PUF更好的性能。实验结果表明,所提出的M_SR PUF可以在超宽范围的环境变化(温度:0°C~80°C;电压:0.8~1.2 V)下稳定工作,平均唯一性为50.125%。此外,所提出的M_SR PUF单元具有低开销的特点,仅消耗4个MUX和2个DFF,并产生适合硬件安全应用的高熵响应。

植物基因分离的图位克隆技术

传统的基因功能克隆、表型克隆方法具有基因表达产物不清楚,难以进行相关基因分离等缺点。目前,图位克隆技术日渐成熟,已成为分离基因的有效方法,并在分离不同的植物基因中得到了广泛的应用。本文简要介绍图位克隆技术原理,并详细阐述图位克隆操作的4个重要技术环节:筛选与目的基因紧密连锁的分子标记、目的基因的定位、构建高质量容易操作的大片段基因组文库和目的基因的筛选和鉴定。本文还概述了近年来利用图位克隆技术分离植物基因的研究成果以及最新研究进展,并对图位技术的应用前景作出展望:在不久的将来,在比较基因组学中统一遗传系统理论的指导下,在具有高多态性水平的以PCR为基础的分子标记日趋饱和的背景下,应用图位克隆技术在植物基因克隆研究中必将取得更加辉煌的成果。

植物基因克隆技术的发展与展望

基因克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分,为了纵览植物基因克隆的理论和技术的发展创新历程,对各种技术体系,正向遗传学途径、反向遗传学途径(包含定位克隆和同源序列克隆及随后发展起来的电子克隆)进行了综述。随着后基因组时代的到来,植物基因克隆技术将发挥更加重要的作用。

抗肺癌单克隆抗体15A1的靶抗原在肺癌细胞中的表达及其转位特征

目的:分析抗肺癌单克隆抗体15A1的靶抗原在肺癌细胞的表达、亚细胞定位和转位的特征,研究15A1的体内外抑瘤功能,为肺癌靶向治疗提供候选抗体药物及靶标。方法:采用免疫荧光及细胞流式术检测单克隆抗体15A1靶抗原在肺癌细胞中的表达及定位,免疫组化分析其在人肺癌组织中的表达;CCK-8法和裸鼠移植瘤体内抗体抑瘤实验评估该单克隆抗体对肺癌细胞的抑制作用。结果:单克隆抗体15A1识别的抗原在人肺腺癌细胞(A549、ANIP-973、GLC-82、Calu-3、H157、H1299)、人肺鳞癌细胞(GLC-P、H520)、人小细胞肺癌细胞(H446、H209)、人大细胞肺癌细胞(PG、H460)共12种细胞的胞内及胞膜上均有表达,肺腺癌细胞的表达强度明显高于其他病理类型肺癌细胞;该抗原在75%的人肺癌组织中非常特异地上调表达。该抗原在肺腺癌细胞中相当一部分从胞核转位至胞质,在肺鳞癌细胞中仅有小部分从细胞核转位至细胞质;转位抗原的一部分表达于膜表面,并同样是肺腺癌细胞的表达强度强于肺鳞癌细胞。该单克隆抗体体内外显著抑制肺癌细胞的生长,抑瘤率在25%～80%。结论:单克隆抗体15A1在体内外能显著抑制肺癌的生长,其靶抗原在人肺癌组织和细胞中特异上调表达,并能以特定转位模式表达于肺癌细胞膜上,可能是一个肺癌靶向治疗的潜在靶标。

抑制食管癌与肺血管内皮黏附的功能性抗体的制备

目的制备抑制食管癌细胞与肺血管内皮黏附的功能性单克隆抗体,为研究食管癌转移的靶向治疗剂打下基础。方法以人食管癌新鲜组织分离的肿瘤细胞免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后,采用活细胞荧光、ELISA、免疫组化、肿瘤细胞-内皮细胞黏附实验、Weasternbloting等方法筛选并鉴定抑制肿瘤细胞黏附的功能性单克隆抗体。结果共融合获得了1134株杂交瘤克隆,在能与食管癌细胞膜反应的486株克隆中,有294株与正常食管上皮不反应或低反应;筛选到15株单抗显著地抑制食管癌细胞与人正常肺血管内皮黏附,其中2株单抗识别的黏附分子相对分子质量分别为30000和60000。结论成功获得了多株具有抑制食管癌细胞与肺血管内皮黏附的功能性抗体,其中2株单抗具有治疗食管癌转移的潜在应用价值。

基于多PUF模组的身份标识与身份认证机制研究

身份认证是保护用户数据的第一道防线,为用户数据安全提供重要的保证。现有的身份认证方法均依赖于凭证服务提供商(CSP)等权威中心,信任其自身管控性和安全防护能力。但是,权威中心对身份标识具有绝对管控权,权威中心一旦失效将带来信息安全隐患。基于此,提出了一种基于多PUF模组的身份标识生成及身份认证机制,将PUF硬件指纹引入认证机制中,设计了一种去中心化身份认证机制。物理不可克隆功能(Physical Unclonable Function,PUF)描述了一种具有唯一性、不可篡改性的物理功能,已在身份认证领域得到了广泛应用,但其易受到使用环境等的影响而失效。现有的基于PUF的身份认证方法均未提供对PUF芯片失效的容忍方案。该文利用多PUF模组关联的方式,提出了提高身份认证机制可用性的解决方案。最后,对所提出的机制从安全性、可行性和可靠性三个方面进行了讨论和证明。

海洋生物功能基因组研究

21世纪是海洋的世纪 ,海洋生物功能基因组研究将因此而成为全球生命科学研究的新热点。通过对国内外海洋生物功能基因组研究的发展现状、发展趋势和该领域的研究方向的综述 ,阐明了开展中国海洋生物功能基因组研究的必要性。

抑制结肠癌细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性抗体的初步研究

目的：研制抑制结肠癌细胞与肝窦血管内皮细胞黏附的功能性单抗,鉴定该单抗识别的抗原分子。方法：以人肝窦内皮细胞（human liver sinusoidal endothelial cell,HLSEC）免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用甲基纤维素选择培养液培养,制备抗HLSEC的单克隆抗体库。采用免疫荧光染色、黏附实验等方法筛选、鉴定能抑制结肠癌Ls174T细胞与肝窦内皮细胞黏附的功能性单克隆抗体。提取肝窦内皮细胞膜蛋白,采用Western blotting方法鉴定单抗识别的功能性抗原蛋白。结果：HLSEC免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合后产生1440个杂交瘤株,获得119株产生抗HLSEC抗体的阳性克隆,其中20株能显著抑制具有肝转移能力的结肠癌Ls174T细胞与HLSEC的黏附;其中15株为IgM型,3株为IgG型,2株测不到重链;其中1株抗黏附能力最强的单抗（黏附抑制率为51%）命名为12B6,该单抗在5～200μg/ml范围内显著阻断HLSEC与Ls174T的黏附,且呈剂量依赖性;单抗12B6所识别的HLSEC抗原蛋白的相对分子质量为46000。结论：建立了抗HLSEC单克隆抗体库,获得了20株具有抑制结肠癌细胞与肝窦血管内皮细胞黏附的功能性抗体,初步鉴定了一种可能参与结肠癌肝转移的黏附分子,为结肠癌的组织器官特异转移机制及靶向治疗的研究奠定了一定的基础。

一株靶向CD90^+ MHCC97-L细胞单克隆抗体治疗肝癌的实验研究

目的:研究抗人肝癌干细胞单抗28C10体内外功能,为肝癌干细胞的靶向治疗提供有应用价值的候选治疗剂。方法:采用无血清成球实验、侵袭实验和CCK-8方法等检测分析28C10单抗对MHCC97-Lsphere的细胞自我更新、侵袭和耐药的影响。裸鼠体内治疗实验研究单抗28C10联合顺铂对MHCC97-L移植瘤生长的作用。Western-Blot方法鉴定该单抗识别抗原的分子量。结果:流式细胞检测结果显示单抗28C10能够识别MHCC97-L中CD90阳性细胞的比例为2.75%。体外功能实验结果显示单抗28C10能显著抑制MHCC97-Lsphere细胞的无血清成球能力和侵袭能力,抑制率分别达33.33%和53.8%。28C10能显著抑制MHCC97-Lsphere的顺铂耐药能力,其IC50为0.74μg/ml,而对照组的IC50为1.42μg/ml。抗体体内治疗实验结果显示,低、高剂量抗体28C10均能抑制肝癌移植瘤的生长,抑制率分别达到了24.0%和67.7%,单独顺铂组肝癌移植瘤的抑制率为35.9%,而顺铂联合高剂量抗体28C10组对肝癌移植瘤的抑制率达到70.1%。Western-Blot结果显示单抗28C10识别的抗原蛋白分子量约100kD。结论:筛选获得了1株抗肝癌干细胞的功能性单抗,为靶向肝癌干细胞治疗肝癌奠定了重要的基础。

魔芋GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因及其启动子的克隆与分析

以花魔芋和白魔芋为材料,通过魔芋5个转录组高通量测序数据库,与拟南芥进行tBlastn比对、拼接,得到魔芋中的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP的推定全长,设计基因特异性引物,克隆得到魔芋GMP基因的部分cDNA序列,长度为1 233 bp,其中基因编码区长度为1 086 bp,编码的氨基酸为361个.在此基础上运用FNPI-PCR技术得到了魔芋GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP上游启动子2 116 bp,经生物信息学分析,该序列具有典型的TATA-box、 CAAT-box及与胁迫相关的元件和光应答元件.

妊娠肝内胆汁淤积综合征的遗传学研究进展

妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)病因复杂,遗传因素在发病机制中起相当关键作用。将胆汁淤积基因FIC、BSEP以及MDR3等作为ICP侯选基因,综述功能克隆、定位克隆及突变功能研究的进展。

基于Gateway技术的植物表达载体的构建

【目的】为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功能基因筛选,利用Gateway技术实现植物表达载体和表达文库的构建,将35S启动子和Gateway技术入门载体pDONR222的同源重组区连接到植物表达载体pCAMBIA0380上,构建Gateway技术兼容的植物表达载体。【方法】分别扩增35S启动子与pDONR222上attP特异识别序列之间的功能区,并将其依次连入根癌农杆菌(Agrobacterium tume faciens)介导的植物表达载体pCAM-BIA0380的多克隆位点区,利用带有attB特异识别区域的GUS基因,对构建的载体功能进行测试。【结果】成功构建了基于Gateway技术的植物表达载体p1104D;载体重组基因的选择性测试结果表明,p1104D对目的基因片段的大小无严格选择性;载体重组效率测试结果表明,p1104D重组平均滴度为5.11×105cfu/mL;GUS报告基因瞬间表达试验结果表明,改造后的载体可以实现目标基因的顺利表达。【结论】基于Gateway技术的植物表达载体p1104D的构建,为实现cDNA文库的高效构建和目标基因的高通量功能筛选提供了可能,有望推动植物-病原互作研究中关键基因的鉴定与克隆。