水稻窄叶突变体nrl2新等位基因的鉴定与功能分析

以籼型两系不育系Y58S的窄叶突变体nrl2(1)为试验材料,对nrl2(1)突变体材料进行表型、组织学分析,发现该突变体主要表现为叶片变窄且卷曲,维管束发育异常,大、小叶脉数显著减少;遗传分析结果表明,该窄叶表型受1对隐性核基因控制;通过基因精细定位,发现NRL2(1)定位在第3染色体46000 bp区间内;图位克隆及候选基因验证结果表明该基因是NRL2的等位基因;测序比对结果显示,突变体的第17个外显子由碱基C变为T,对应的氨基酸由谷氨酰胺变为终止密码子,造成翻译提前终止。以nrl2(1)为亲本材料,选育两系不育系,预期可选育出叶片较窄、株型紧凑、分蘖多的新型两系不育系。

思茅松1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)基因的克隆及功能分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)是甲基–D–赤藓醇–4–磷酸(MEP)途径中的第一个酶,也是限速酶。本文根据思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis(A.Chev.)Gaussen)树皮转录组数据分析结果,获得思茅松DXS基因片段,然后根据获得的基因片段设计特异引物,运用RT-PCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得到完整的DXS基因(Pk DXS1)。Pk DXS1基因的c DNA全长序列2 888 bp,含有1个2 223 bp的开放阅读框(ORF),编码740个氨基酸,该基因推断的蛋白与赤松(Pinus densiflora Siebold&Zucc)DXS蛋白的相似性为99%,与欧洲云杉(Picea abies(L.)H.Karst.)DXS的相似性为97%;经氨基酸序列比对,推断思茅松DXS具有高等植物DXS酶特有的叶绿体转运肽,二磷酸硫胺结合位点和转酮醇酶结构域。半定量RT-PCR检测表明树皮的创伤促进DXS基因的表达。

滇牡丹ω-3脂肪酸脱氢酶基因克隆与功能分析

ω-3脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸亚麻酸生物合成途径的关键酶。依据转录组数据设计特异性引物,使用RT-PCR方法从滇牡丹克隆得到1个FAD3基因的c DNA全长序列,命名为Pd FAD3(Gene Bank登录号为KX289610)。生物信息学分析结果表明Pd FAD3基因片段序列全长2 134 bp,包含完整的c DNA开放阅读框,编码含有450个氨基酸残基的蛋白质;Blast比对结果显示该蛋白质属于FAD蛋白质家族;系统进化树分析结果显示与芍药属芍药组植物芍药亲缘关系较近;该蛋白质属于跨膜蛋白质,亲水性较低;RT-PCR结果显示其在种子中的表达随着种子成熟出现双峰型的表达量变化,与目前所报道的其他物种的FAD3表达情况相似。为进一步研究其调控机理提供理论依据及获得含高不饱和脂肪酸转基因滇牡丹品种奠定理论基础。

家族性肾阳虚的基因功能富集分析

在临床调查中筛选出一个典型肾阳虚证家系,选取典型肾阳虚证患者3例及家系内正常人3例进行表达谱芯片试验.芯片分析结果显示,肾阳虚证者表达上调基因106条,下调基因16条.通过基因功能分类及深入的基因功能富集分析发现,肾阳虚证与GnRH信号通路及氧化磷酸化密切相关(P≤0.05),从而为肾阳虚证本质的研究提供了新的思路,但具体的机制有待深入研究.

油菜FAD2基因的克隆与功能分析

油酸去饱和酶FAD2基因催化C18∶1脂肪酸脱氢生成C18∶2脂肪酸,直接决定了油料作物的油脂品质,同时对植物的抗冻能力至关重要。通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种＂中双9号＂中克隆了Bn FAD2基因的全长c DNA序列,该基因编码一个长384aa的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子量44.2 ku,等电点pI值为8.54,对应的基因组序列无内含子。使用荧光定量RT-PCR发现它在种子发育到25 d时转录水平最高;使用生物信息学手段发现该蛋白具有6个跨膜区,定位在内质网膜上,不含信号肽。将该基因克隆到植物转基因载体pBILP2PTNap中,通过农杆菌LBA4404介导转化了拟南芥fad2基因突变体,使其在种子中超量表达,共获得20株转基因阳性植株。使用气相色谱法比较野生型植株、突变体植株、转基因阳性植株种子中脂肪酸的组成成分,结果发现转基因前后,种子中油酸（C18∶1）的含量从53.8%降低到12.4%-34.1%,亚油酸（C18∶2）含量从2.9%提高到11.5%-62.7%,说明这些转入的Bn FAD2基因在不同植株中均能不同程度地互补fad2突变体的表型,证明克隆得到的油菜BnFAD2基因具有完整的催化功能。

萎缩芽胞杆菌CKL1促盐胁迫下燕麦生长活性及其功能基因分析

【背景】青海省特殊生境孕育了特殊微生物资源。【目的】探究适合生活于高原生境的芽胞杆菌菌源。【方法】采用平板对峙法、显色法对萎缩芽胞杆菌(Bacillus atrophaeus)CKL1的拮抗、产吲哚乙酸活性进行测定,并检测耐低温、耐盐性及菌株对盐胁迫下燕麦品种(Avena sativa)“青燕1号”种子萌发、幼苗生长效应及叶绿素、脯氨酸、丙二醛的含量变化,利用二代测序技术对菌株进行基因组测序并分析相关功能基因。【结果】菌株CKL1对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)表现出显著的拮抗活性(抑菌圈直径>15 mm);与Salkowski比色液反应变红,能在NaCl浓度为13%的LB培养基及4℃低温下生长,表现出一定的产吲哚乙酸、耐盐及耐低温活性;盐胁迫下,菌株CKL1对“青燕1号”种子萌发及幼苗生长具有显著促进作用,叶绿素及脯氨酸含量显著增加,丙二醛含量下降,增强了燕麦的抗盐性。菌株CKL1基因组全长为14281280 bp,与GO功能数据库比对注释到3303个功能基因;基因组编码与脂肽类化合物iturin、surfactin合成及与吲哚乙酸合成相关基因,编码与逆境应答相关Na+/H+逆向转运蛋白及脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质合成相关基因簇,编码参与高盐及低温胁迫应答转录调控因子的关键基因。【结论】本研究为利用芽胞杆菌促盐胁迫下燕麦生长、提高燕麦抗盐性提供了优异菌株及理论依据。

基于基因组预测和分析甘薯间座壳菌(Diaporthe batatas)分泌蛋白中效应因子

甘薯间座壳菌(Diaporthe batatas)是引起甘薯基腐病的病原菌之一,近年来在中国东南沿海发生较为普遍。由于效应因子在致病过程中发挥着重要作用,本研究采用SignalP 5.0、GPI-SOM、WoLF PSORT、TMHMM-2.0和EffectorP 3.0等生物信息学软件,对甘薯间座壳菌效应因子进行预测和分析。结果表明,从D.batatas全基因组编码的13864个蛋白质中筛选到359个候选效应因子,其中248个为质外体效应因子,68个为胞内效应因子,43个既可能是质外体效应因子又可能是胞内效应因子。在信号肽分析中,所有候选效应因子信号肽长度为14~37个氨基酸,在信号肽切割位点-3位到+2位出现频率最高的氨基酸分别为丙氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸。利用HMMER、DIAMOND和eCAMI 3个软件对359个候选效应因子进行碳水化合物活性酶(CAZyme)类分析,结果表明,有89个蛋白质属于CAZyme,其中糖苷水解酶类最多。eggNOG-mapper分析结果显示,在359个候选效应因子中有227个具有功能注释,主要涉及碳水化合物转运和代谢,翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣等生理过程。通过qRT-PCR检测9个候选效应因子基因在D.batatas侵染过程中的相对表达水平,发现有7个候选效应因子基因在侵染过程中显著上调,有2个没有显著变化。这些结果的获得为明确甘薯间座壳菌效应因子的功能,分析甘薯基腐病发病机理,筛选寄主抗性基因及研发特异性靶向农药提供了参考。

芒果MiZAT10A和MiZAT10B功能分析

【目的】锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)在植物非生物胁迫应答中起重要的作用,研究两个锌指蛋白基因MiZAT10A和MiZAT10B转入拟南芥对盐、干旱、重金属以及外源激素等非生物胁迫的应答,为抗逆育种提供理论依据。【方法】利用在线软件PLACE和MEME分别对芒果MiZAT10A和MiZAT10B进行启动子顺式作用元件以及motif预测和分析,并利用TBtools软件和‘四季蜜芒’基因注释文件(GFF文件,未公开)绘制染色体定位图;通过实时荧光定量分析MiZAT10A和MiZAT10B的组织表达模式;构建芒果MiZAT10A和MiZAT10B超量表达载体,采用农杆菌花序浸染法转化模式植物拟南芥,观察并记录转基因拟南芥开花表型以及在盐、干旱、重金属以及外源激素脱落酸和赤霉素处理下的根生长情况。【结果】启动子顺式元件分析显示,两个基因的启动子区域都有许多光响应元件、激素响应元件和非生物胁迫响应元件。表达模式分析显示,MiZAT10A与MiZAT10B在芽和花中表达水平最高。MiZAT10A和MiZAT10B分别获得了9株和14株转基因拟南芥,开花表型分析显示,MiZAT10A和MiZAT10B转基因拟南芥提早开花。在盐胁迫、干旱胁迫和重金属胁迫以及GA3和ABA激素处理下,两个超量表达转基因拟南芥的根长显著长于WT。【结论】超量表达的MiZAT10A与MiZAT10B可使转基因拟南芥提前开花并提高其对盐、干旱、重金属及外源激素GA3和ABA的抗性。

西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统hrcQ基因功能分析

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)是影响西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli致病性的重要因素,hrcQ作为T3SS的保守基因,在组成和维持该系统功能方面扮演着重要角色,但hrcQ在西瓜噬酸菌中的具体生物学功能尚不明确。本试验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过基因敲除、致病力及相关表型测定等,解析了hrcQ基因的功能。结果表明:hrcQ缺失导致Aac5菌株对寄主的致病能力丧失,运动性及生物膜形成能力降低,并丧失了引起烟草过敏性反应能力;hrcJ和hrcR基因在hrcQ缺失突变株中的表达量下调,hrcQ对hrcJ和hrcR基因均为正调控。表明hrcQ在维持西瓜噬酸菌致病能力中起着不可或缺的作用。

滇牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶基因的克隆与功能分析

ω-6脂肪酸脱氢酶(FAD2)是亚油酸合成的关键酶,催化油酸脱氢形成亚油酸。以滇牡丹种子为材料,研究根据转录组数据设计的特异引物,采用RT-PCR方法,克隆滇牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(FAD2)并分析其功能。获得一个ω-6脂肪酸脱氢酶基因,将其命名为Pd FAD2。结果表明,该基因与芍药的同源性为98.7%。经氨基酸序列比对,推断滇牡丹FAD2具有植物FAD2特有的3个组氨酸区,包含完整的c DNA开放阅读框,由1 155bp组成,编码384个氨基酸残基。半定量PCR的结果显示,滇牡丹FAD2基因在花、茎、叶、种子中均有表达,在根中只有微弱表达。研究结果为研究滇牡丹不饱和脂肪酸代谢奠定基础,也为油用滇牡丹育种提供理论依据。

滇牡丹3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆与功能分析

3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase,简称KCS)是超长链单不饱和脂肪酸生物合成途径的关键酶。依据转录组数据设计特异性引物,使用RT-PCR方法从滇牡丹(Paeonia delavayi)中克隆得到1个KCS基因的cDNA全长序列,命名为PdKCS(Gen Bank登录号KX524949)。生物信息学分析结果表明,PdKCS基因片段序列全长1527 bp,包含完整的cDNA开放阅读框(ORF),编码含有502个氨基酸残基的蛋白质;Blast比对结果显示,该蛋白质属于KCS蛋白家族;系统进化分析结果显示,该蛋白质属于跨膜、亲水性蛋白;RT-PCR结果显示,其在种子中的表达随着种子的成熟出现双峰型的表达量变化。研究结果可为进一步研究该蛋白的调控机制提供理论依据及获得含高不饱和脂肪酸转基因滇牡丹品种奠定理论基础。

油菜黄籽基因克隆和功能分析研究进展

油菜黄籽育种是当前一个研究热点。但黄籽形成的分子机制并未阐释清楚。在简要介绍植物基因克隆和功能分析的基本方法的基础上,综述了应用这些方法克隆油菜种皮颜色形成相关基因、分析这些基因在油菜种皮颜色形成中作用已取得的进展,并探讨了油菜黄籽基因的克隆和功能分析的发展方向。

多发性骨髓瘤/浆细胞白血病差异表达基因生物学功能、关键基因表达水平及其与预后的关系

目的筛选出多发性骨髓瘤(MM)与浆细胞白血病(PCL)之间的差异表达基因,了解其生物学功能,明确关键基因表达水平与MM预后的关系。方法从公共基因芯片数据库(GEO)中下载MM与PCL芯片数据集GSE66291和GSE70323,在R软件中用Limma包分别筛选差异表达基因(DEGs)并取交集。利用基因本体(GO)以及京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析对DEGs进行功能和通路注释,使用Sring对交集的DEGs构建蛋白质—蛋白质互作网络(PPI),筛选关键基因,使用Cytohubba插件筛选相关度前20位的关键基因,最后在GSE24080中根据关键基因的表达水平将MM患者分为高表达组及低表达组,比较高低表达组的总体生存率。结果共获取DEGs 389个,120个上调,269个下调。GO分析结果显示:在细胞组分方面主要与细胞膜外区域相关;在生物过程方面,参与白细胞游走、中性粒细胞聚集、体液免疫等;分子功能方面,主要与抗原结合相关。KEGG结果提示DEGs在细胞黏附分子、局灶性黏附等相关通路上富集。筛选出CDH1、CD44等20个关键基因,其中CXCL12、CDH1、RNASE3、LYZ、PPBP、VCAM1、QPCT、PECAM1与MM高表达组MM患者的总体生存率高于低表达组(P均<0.05)。结论MM与PCLD的DEGs中120个上调,269个下调。DEGs主要与细胞膜外区域相关,参与白细胞游走、与抗原结合、调控细胞黏附分子及局灶性黏附等相关通路。CXCL12、CDH1、RNASE3、LYZ、PPBP、VCAM1、QPCT和PECAM1可能是与MM患者预后相关的关键基因,其高表达组MM患者预后较好。

企鹅源禽1型副黏病毒基因组序列分析

为了从分子水平上探讨企鹅源禽1型副黏病毒BP01的演化,根据GenBank登录的鹅源禽1型副黏病毒基因序列设计引物,运用RT-PCR方法于国内外首次测定了企鹅源禽1型副黏病毒全基因组序列,其全长为15192nt。经分析表明BP01病毒基因组与SF02株和ZJ1株等鹅源禽1型副黏病毒同源性最高,分别为99.1%和99.0%;与IT-227/82和dove/Italy/2736/00等鸽源禽1型副黏病毒同源性分别为90.2%和88.1%;而与Hert/33和LaSota等鸡源禽1型副黏病毒的同源性最低,仅分别为87.9%和83.2%。对F基因第47～435nt进行系统进化树分析和F基因第334～1682nt进行HinfⅠ、BstOⅠ、RsaⅠ酶切位点分析,确定BP01株病毒为基因Ⅶ型。F蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合禽1型副黏病毒强毒株的特性,经预测发现BP01株病毒F蛋白的七肽重复序列分别在第143～189位氨基酸残基和第461～503位氨基酸。通过对主要毒力基因推导的氨基酸序列进行比较发现,水禽源与其它源F蛋白有14个氨基酸不同,HN蛋白上有2个氨基酸的不同,而P蛋白有20个氨基酸的不同,且在第151～166位氨基酸存在一个明显的突变域。

国家自然基金项目《大豆暗诱导下光周期相关基因的差异表达、克隆与基因功能分析》通过验收

由李文滨教授主持的国家自然基金项目《大豆暗诱导下光周期相关基因的差异表达、克隆与基因功能分析》通过验收。

思茅松HDR基因全长cDNA克隆与序列分析

1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径中的最后一个酶,在植物萜类生物合成中起主控作用。该研究根据思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)树皮转录组数据分析结果,首先获得了思茅松HDR基因片段,然后根据所获得的基因片段设计特异引物,提取受伤后的思茅松树皮的RNA,并运用RT-PCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得到完整的HDR基因(Pk HDR)。生物信息学分析表明:克隆获得的Pk HDR1基因c DNA全长序列为1 876 bp,含有1个1 464 bp的开放阅读框(ORF),编码487个氨基酸。同源性分析结果表明:思茅松HDR蛋白与赤松(Pinus densiflora)HDR蛋白的相似性高达99%。亚细胞定位及结构域分析结果表明:思茅松Pk HDR氨基酸序列中包含转运肽序列(A1-A61)及植物HDR蛋白多个保守的功能位点(A143,A234,A288,A371)。系统进化分析结果表明:Pk HDR蛋白与赤松HDR蛋白的亲缘关系最为接近。半定量PCR检测结果表明:树皮的创伤促进思茅松HDR基因的表达。该研究成功克隆获得HDR基因,并确定其与松脂代谢密切相关,为阐明思茅松松脂生物合成机制和分子育种提供了参考。

植物基因功能鉴定新工具——病毒诱导基因沉默技术的研究进展

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术是指带一段靶基因序列的VIGS重组病毒侵染植物、引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的从反向遗传学方向快速鉴定植物基因功能的技术,是转录后基因沉默机制的一种表现。①VIGS的分子机制,涉及基因沉默的起始、维持和信号放大、传播共3个阶段;②VIGS技术、载体与方法学的发展;③VIGS作为基因功能研究的优越性,如不必进行转基因、操作方法简便、获得结果快速等;④应用VIGS对植物抗病途径、代谢与发育调控中参与基因功能进行研究的概况。同时,展望了VIGS技术作为植物功能基因组学功能分析的高通量技术平台的美好前景。

转GmHAP3-17基因大豆的抗旱性分析

Gm HAP3-17基因是一个与At HAP3-1同源的转录因子,本研究利用超表达Gm HAP3-17大豆,在模拟干旱条件下以及田间干旱试验下进行了转基因大豆的抗旱性分析。结果显示:在大棚盆栽模拟干旱胁迫条件下,转基因大豆H16、H18、H26比野生型大豆WT根系发达,主根长且侧根较多,植株生长状态比对照好,叶片枯萎发生较迟、程度较轻。转基因大豆与野生型相比,MDA含量低,叶片伤害度较轻,叶片含水量较高。进一步研究表明,在田间自然干旱胁迫下,转基因大豆同样表现出较好的生长状况,较低的叶片伤害度和较高的叶片含水量。在自然干旱条件下,与野生型大豆相比,转Gm HAP3-17基因大豆表现为根系发达、扎根深、侧根多,增加了株高、主茎节数、有效分枝数。H26株系的有效荚数、单株粒数、单株粒重、百粒重均比野生型提高明显,表现出了显著的产量优势。上述结果表明:GmHAP3-17基因具有正调控干旱的功能,因而该基因将成为培育抗旱转基因作物的一个有效的基因资源。

日本血吸虫一种新腺苷酸激酶全长cDNA的克隆与功能分析

目的 对用表达序列标签 (Expression Sequence Tag,EST)策略从日本血吸虫尾蚴 c DNA文库中筛选出的新基因进行功能预测。方法 用 NCBI站点的 BL ASTx及 BL ASTn程序对所获得的新基因序列进行同源性搜索 ;用 NCBI BLAST站点的 blast two sequence程序对同源性高的基因进行核苷酸及氨基酸水平的同源性比较 ;利用 Motif Scan in a Protein Sequence对 c DNA序列所编码的蛋白质进行结构域搜索 ;利用 CD-Search程序对目标蛋白进行保守区域搜索。结果 发现一个与曼氏血吸虫 2 2 k Da单核苷酸激酶 m RNA高度同源的日本血吸虫新基因 ,基因与氨基酸水平的同一性均分别为 86.0 %和 87.0 % ;蛋白结构域搜索及保守区域搜索结果显示 ,该 c DNA序列所编码的蛋白质是一种腺苷酸激酶。结论 用 EST策略筛选新基因是一个可行的方法 ,所筛到的日本血吸虫新基因编码一种腺苷酸激酶 ,全长编码序列与曼氏血吸虫腺苷酸激酶 m

基于生物信息学方法对慢性鼻窦炎伴鼻息肉差异基因表达的分析

背景慢性鼻窦炎伴鼻息肉是常见的慢性炎症性疾病,其术后复发率高,发病机制尚未完全明了。目的通过生物信息学方法筛选出慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者的息肉组织与正常对照鼻黏膜的差异基因,为慢性鼻窦炎伴鼻息肉的分子生物研究和生物标志物筛选提供理论依据。方法从GEO数据集中选取GSE136825,提取出42例慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者的息肉组织和28例健康对照者的鼻黏膜组织的高通量测序数据,利用R语言及Deseq2包分析差异表达基因,利用Metacore数据库进行差异基因的基因本体论(gene ontology,GO)富集分析和通路富集分析,并通过Cytoscape软件构建蛋白-蛋白相互作用网络,寻找在疾病中发挥作用的关键基因。结果共筛选得到777个差异表达基因,其中上调基因527个,下调基因250个。对差异基因进行功能和通路富集分析,显示炎症反应、免疫受体活性、粒细胞趋化、金属肽酶活性等生物学功能在鼻息肉组织与正常黏膜组织之间存在显著相关性。进一步得到与CRSwNP相关的核心基因SCG2、IGFBP3、CA4、C3、SPP1、CP、CHRDL1、BPIFB2。以上核心基因中SCG2、IGFBP3、CA4、C3、SPP1、CP在鼻息肉组织中表达上调,CHRDL1、BPIFB2在鼻息肉组织中表达下调。结论本研究有助于加强对慢性鼻窦炎伴鼻息肉相关分子机制的了解,为该疾病的临床和机制研究提供一定基础。