谷氨酸棒杆菌GPAT功能基因鉴定与分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)是三酰基甘油(TAG)合成过程中的关键酶。以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CG14为研究对象,利用生物信息学预测了Corynebacterium glutamicum ATCC13032编码GPAT的多个候选功能基因,并选择其中之一cg2777基因进行后续验证,该基因具有典型的GPAT的基因结构域,包含4个跨膜结构域,其编码的氨基酸序列与多种产油细菌来源的GPAT的基因序列具有很高的相似度;通过构建基因cg2777敲除菌株和过表达菌株,结合发酵验证分析,推测基因cg2777行使GPAT功能,但是油脂合成是一个多酶作用的复杂生物催化过程,单一过表达基因cg2777并不能显著提高胞内油脂含量。

大豆胞囊线虫病4号生理小种抗性候选基因GmRSCN4-3克隆与功能初步鉴定

大豆胞囊线虫病(Heterodera glycines,Soybean cyst nematode,SCN)是一种土传专化性内寄生大豆根系的世界性大豆病害,二龄幼虫可入侵大豆维管组织周围,导致大豆根部组织变形并形成"合胞体",造成大豆生产严重损失。借鉴已有研究成果,以抗大豆胞囊线虫病种质东农L-10为试验材料,克隆抗病候选基因GmRSCN4-3的CDS序列并构建植物表达载体p Cambia3300-GmRSCN4-3,利用发根农杆菌转化大豆感病材料东农50验证候选基因抗病性。结果表明,候选基因GmRSCN4-3在转基因植株与空白对照的雌虫指数之间存在显著差异,即GmRSCN4-3参与大豆对大豆孢囊线虫病4号生理小种抗性反应,研究为大豆抗SCN分子育种提供理论依据和基因基础。

基因组编辑技术在植物基因功能鉴定及作物育种中的应用

利用生物技术可以对植物基因组进行高效、精准、特异的修饰。锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)、成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9(CRISPR-associated 9)是目前基因组编辑技术应用中的关键工程核酸酶。通过产生DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)激活植物内源修复途径(包括非同源粘性末端连接和同源重组修复),基因组编辑技术可以实现对靶位点的定点突变、缺失或者基因的插入与替换。基因组编辑已经被广泛地应用到各种植物的基因组修饰中,如拟南芥、水稻、烟草等。本文主要概述了基因组编辑技术在植物基因功能鉴定及作物遗传育种中的应用,并对其未来在作物精准改良中需要完善的相关问题进行了探讨。

大豆异黄酮相关基因GmUGT73克隆及功能初步鉴定

UGT是一类糖基转移酶,它对黄酮类化合物进行糖基化修饰,合成异黄酮糖苷,在异黄酮的合成、转运、存储等方面发挥了重要的作用。为了探索UGT功能,通过RT-PCR方法从中豆27中克隆获得GmUGT73基因的CDS全长序列。利用ProtParam tool等在线软件对GmUGT73蛋白序列及理化性质进行分析,预测结果表明,GmUGT73基因的编码区编码464个氨基酸,分子质量为51.186 5 ku,理论等电点(pI)为6.27,总原子数为7 176,分子式为C2281H3580N608O685S22。GmUGT73蛋白总正电和负电残基数分别为37和41,蛋白的不稳定系数为36.93,表明该蛋白较稳定,蛋白的脂溶指数为86.19,GRAVY值为-0.111,说明该蛋白为亲水性蛋白。将线性植物表达载体与目的片段进行连接,成功构建pCambia3300-GmUGT73植物表达载体,通过发根农杆菌介导法转化大豆毛状根并获得转基因阳性根系,利用高效液相色谱(HPLC)对根系进行异黄酮含量测定,结果表明,转基因阳性根中异黄酮含量与对照相比极显著提高(P<0.01),说明该基因可能具有促进合成大豆异黄酮的功能。

CRISPR/Cas9技术在药用植物功能基因组研究中的应用和展望

基因编辑是对基因组实现定点修饰的一项技术,其中CRISPR/Cas9系统以其操作难度低、编辑效率高、编辑范围广、投入成本少等优势成为新一代基因编辑技术,并在植物基因组学的研究中得到了广泛的应用。本文介绍了CRISPR/Cas9系统及其相关技术的工作原理,论述了编辑效率的影响因素、编辑系统的转化方式以及编辑结果的分析方法;从药用植物基因功能鉴定和转录调控两个方向,着重综述了该技术在药用植物功能基因组研究中的应用情况,并对其面临的问题和应用前景进行了总结与展望。

大豆胞囊线虫病3号生理小种的抗性候选基因GmRSCN3-2的初步鉴定

大豆胞囊线虫病3号生理小种(SCN3)是我国东北大豆产区的优势生理小种、危害较为严重,目前我国大豆生产上缺少抗病品种;然而常规育种方法培育抗性品种存在准确性差、遗传进程慢的缺点,因此分子辅助育种已成为培育抗性品种的有效途径之一。本研究根据前人的研究结果以抗大豆胞囊线虫病种质东农L-10为试验材料,克隆了抗病候选基因GmRSCN3-2的全长序列并构建了植物表达载体pCXSN-HA/GmRSCN3-2,进而利用发根农杆菌转化大豆材料来验证该候选基因的抗病性。结果表明:候选基因GmRSCN3-2在转基因植株阳性根内的平均雌虫数与空白对照植株根内的平均雌虫数存在显著差异,即GmRSCN3-2对大豆胞囊线虫病具有明显的抗性。

病毒诱导的基因沉默及其在植物研究中的应用

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)在植物的基因功能鉴定中是一个非常有用的工具,在植物中了得到广泛应用。与传统的研究植物基因阻断的方法相比,VIGS具有简便高效、周期性短、不需要对植物进行转化以及可以沉默基因家族等特点,而且在一定条件下其沉默效应还能够传递给后代。介绍了VIGS的原理与操作过程,综述了该技术的应用与研究成果,有助于推动其在植物尤其是农作物育种中的进一步应用与发展。

在小麦上实施基因沉默的VIGS系统优化

以大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)改造的VIGS(Virus induced gene silencing)载体在单子叶植物中能够介导基因沉默,因此BSMV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。本试验通过在近等基因系TcLr24中对BSMV VIGS载体系统进行优化,以保证更方便地在小麦近等基因系(NIL)中实施VIGS功能验证。

花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因家族生物信息学分析

氮素利用效率(nitrogen utilization efficiency,NUE)是影响花生产量的重要因素之一。基于前期产量相关性状全基因组关联分析锚定到的一个候选基因,属于花生高亲和硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter 2,NRT2)基因家族。本研究利用栽培种花生全基因组和不同组织的转录组信息,对NRT2家族成员进行了全基因组鉴定与表达模式分析。共鉴定到10个NRT2基因家族成员,染色体定位分析结果显示这些基因不均匀地分布在20条染色体上。其中,3号(AhNRT2.5c)和13号(AhNRT2.5b)染色体,6号(AhNRT2.7b)和16号(AhNRT2.7a)染色体上的基因成员存在同源关系。AhNRT2.4,AhNRT2.5a,AhNRT2.5b和AhNRT2.5c四个基因在根组织中表达量较高,表明这些NRT2基因在根系中发挥重要作用。该结果为进一步研究花生NRT2基因家族及在氮转运过程中的作用机制提供了理论依据。

牛樟芝actri5基因的克隆与最佳表达培养基的筛选

为探讨牛樟芝单端孢霉二烯合酶( actri5 )基因与单端孢霉烯类化合物间的关系,从牛樟芝基因组中分离并克隆 actri5 基因,对其进行生物信息学分析和表达谱分析,以获得该基因的最佳表达培养基。结果表明, actri5 基因含5个外显子、4个内含子,其蛋白与根纤维孔菌( Fibroporia radiculosa, XP_012177824 )的TRI5蛋白的一致性为46%;ACTRI5蛋白不含信号肽,无跨膜结构,定位于细胞质基质的内质网上;序列比对分析显示该蛋白含有Mg2+绑定位点(DDXXX)、焦磷酸与二价离子螯合区域(NDXXSFYKE)及FPP结合基序(XXRYRL)3个保守结构域;聚类分析结果显示牛樟芝ACTRI5与绣球菌TRI5( SparassiScrispa, XP_027613108 )、变色栓菌TRI5( TrameteSversicolor, XP_008037460 )、球孢白僵菌TRI5( Beauveria bassiana, XP_008596951 )、里氏木霉TRI5( Trichoderma reesei, XP_006964535 )和 AspergilluScostaricaensiSTRI5( XP_025537855 )聚为一支,该分支均编码单端孢霉二烯合酶;actri5 基因在以果糖为碳源添加物及以番茄浸粉、酪蛋白胨和胰蛋白胨为氮源添加物的培养基上表达,而在其他培养基上不表达。本研究为牛樟芝中 tri5 基因功能的进一步研究、单端孢霉烯族化合物检测和异源表达奠定基础。

大豆胞囊线虫病抗性候选基因GmRSCN-6克隆与表达分析

大豆胞囊线虫病(Heterodera glycines,Soybean cyst nematode,SCN)是世界性大豆病害之一,具有致病力强、传播范围广、休眠体(胞囊)存活时间长等特点。因此,大豆胞囊线虫病极难防治。筛选并利用抗病基因是加快大豆抗线育种进程的有效途径之一。本文以东农L-10为材料,克隆GmRSCN-6基因并分析GmRSCN-6蛋白的性质,同时对该基因在抗感病品种进行表达分析。结果表明GmRSCN-6在SCN3号生理小种侵染10 d内逐渐上调表达。3 d时表达量出现小高峰,推测GmRSCN-6基因响应SCN3号生理小种入侵信号,10 d时GmRSCN-6基因的表达量达到最大,且抗病品种中的表达量远高于感病品种,表明GmRSCN-6基因参与大豆胞囊线虫病3号生理小种抗性反应。

一个含有CMeT新型NR-PKS基因的克隆与鉴定

地衣中含有种类丰富并具有生物活性的聚酮类化合物,目前对地衣聚酮类化合物的生物合成尚不清楚。本研究通过对皮革肾岛衣地衣型真菌转录组数据的分析,获得一个新的含有甲基转移酶结构域的非还原型聚酮合酶(NR-PKS)基因(NpPKS1),利用RT-PCR技术首次从皮革肾岛衣地衣型真菌中克隆得到该基因全长cDNA,并检测不同培养基对NpPKS1基因表达的影响。结果显示:NpPKS1基因cDNA全长7 857 bp,编码2 618个氨基酸;该蛋白不存在信号肽,在细胞质基质中发挥作用;与含有甲基转移酶结构域的构巢曲霉(Aspergillus nidulans, XP664052)、壳球孢菌(Macrophomina phaseolina, EKG19938)聚为一支;表达分析显示该基因在不同培养基上的表达量差异极其显著,在BMG培养基上的表达量最高,其相对表达量可达39.15。本研究为下一步异源表达皮革肾岛衣地衣型真菌的聚酮合酶、探讨皮革肾岛衣聚酮化合物的生物合成及基因资源的有效利用提供必要的研究材料。

拟南芥脯氨酸合成关键酶P5CS1的功能鉴定及原核表达

在拟南芥中超表达P5CS1基因同时,对P5CS1蛋白原核表达条件进行摸索。结果表明:P5CS1超表达植株在正常生长和盐胁迫条件下脯氨酸积累均得到了显著增强,在培养基培养和土培条件下耐盐性均显著高于对照。原核表达结果显示,P5CS1蛋白在温度28℃、0.8mmol·L^(-1) IPTG条件下有高水平的诱导,且存在于大肠埃希菌的包涵体中。这一研究证实了P5CS1在脯氨酸积累中的作用及对渗透胁迫条件下植物的保护作用,其表达1个分子量约为76ku的融合蛋白。

谷子毛状根诱导方法的建立与优化

为建立一种快速鉴定谷子基因功能的技术体系,本研究通过比较谷子外植体、品种、乙酰丁香酮、菌液浓度和共培养时间对发根农杆菌K599介导的毛状根诱导效率的影响,发现发根农杆菌浓度在OD600为0.5、以谷子芽尖为外植体、在含有100μmol L–1乙酰丁香酮的毛状根诱导培养基上共培养3 d时,可使毛状根诱导率高达80.24%。将GFP基因进行毛状根遗传转化,通过GFP基因的PCR扩增和GFP荧光观察结果分析,发现谷子毛状根的转基因效率大于70%。利用该体系对谷子SiDVL1和SiDVL3的亚细胞定位和SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7基因功能进行了分析和鉴定。结果表明SiDVL1和SiDVL3在谷子毛状根中的亚细胞定位与在烟草叶片中的一致;SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7转基因谷子的存活率显著高于空载体转化谷子。说明本研究建立了一种高效快速鉴定谷子基因定位和功能的方法。

植物基因替换编辑技术研究进展

基因替换编辑是通过核酸酶介导的对目标基因进行定点敲入或替换的编辑技术,可以实现目的基因的定向修饰。本文从基因替换编辑技术的原理、实现方式与影响因素、应用及其前景等进行了总结与讨论,以期为通过定点基因替换或敲入技术开展高等植物基因功能鉴定与遗传改良研究提供参考。