抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体的构建和表达

构建和表达抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体 ,并测定该微型双功能抗体的生物学活性。采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体 ,并用双脱氧终止法测定DNA序列 ;采用亲和层析法纯化该产物 ,并用Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物 ;采用免疫荧光法、放射免疫分析法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。DNA序列测定结果表明 :抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体已构建成功 ,表达可溶性产物的产量达 2mg L以上 ,纯化产物中二聚体的比例达 90 % ,具有与Jurkat(CD3 + )和K5 62 A0 2细胞 (Pgp+ )结合的活性 ,与抗CD3ScFv及抗PgpScFv的亲合常数相当。成功地构建了抗CD3 抗Pgp微型双功能抗体 ,并获得高效表达 。

抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的构建、表达及活性测定

背景与目的:微型双功能抗体是基因工程抗体的一种形式,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用。本实验构建抗CD3/抗CD19微型双功能抗体(diabody)载体,表达纯化后测定其生物学活性。方法:用重叠PCR(overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/抗CD19 diabody载体,转化感受态大肠埃希菌进行原核表达。表达产物经抗His-tag亲和层析柱分离纯化,12% SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测生物学活性。结果:基因重组质粒经测序证实序列正确。抗CD3/抗CD19 diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达。12% SDS-PAGE显示28×103和26×103各有一条带,Western blot在28×103显示有条带,与预期相符。表达产物经纯化定量可达5mg/L。FACS检测抗CD3/抗CD19 diabody可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合活性。结论:本实验成功构建了抗CD3/抗CD19 diabody,并且能够进行可溶性表达,可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,为以后的抗体功能实验奠定了基础。

微型双功能抗体抗CD3/抗CD20的构建和表达

目的 :构建和表达抗CD3/抗CD2 0微型双功能抗体 ,并测定该微型双功能抗体的生物学活性。方法 :采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD3/抗CD2 0微型双功能抗体 ,并用双脱氧终止法测定DNA序列 ;采用亲和层析法纯化该产物 ,并用Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物 ;采用FACS法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果 :DNA序列测定结果表明 :抗CD3/抗CD2 0微型双功能抗体已构建成功 ,表达可溶性产物的产量达 1mg/ml以上 ,纯化产物中二聚体的比例达 90 % ,具有与Jurkat(CD3+ )和Daudi细胞 (CD2 0 + )结合的活性 ,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环。结论 :利用Diabody形式 ,首次成功地构建了抗CD3/抗CD2 0微型双功能抗体 ,并获得较高表达 ,表达产物具有与相应

双功能抗体抗CD3／抗CD19介导T细胞对靶细胞的杀伤作用

背景与目的:双功能抗体有2个抗原结合臂,一方面具有肿瘤相关抗原,另一方面具有和免疫效应细胞表面分子标记结合的能力,并能有效地使效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞的作用。本实验探讨抗CD3/抗CD19双功能抗体介导T细胞杀伤靶细胞的作用。方法:利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞作为效应细胞。首先以Raji细胞为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度分组,以PBS、抗CD3scFv+、抗CD3scFv抗体及非相关抗体抗CD3/抗PGP为对照,另设CD19-K562细胞为非相关靶细胞组,比较双功能抗体介导特异性体外杀伤活性。取上述杀伤实验效靶比25∶1,抗体浓度500 ng/mL各组,ELISA法比较激活的T细胞分泌IL-2的量,Real-time PCR法检测T细胞因子IL-3、IFN-γ、TNF-α激活后的表达变化。结果:体外介导T细胞杀伤靶细胞Raji的效果比对照组明显增强(P<0.05),激活T细胞分泌IL-2、IL-3、IFN-γ及TNF-α的表达均明显高于对照组。结论:双功能抗体抗CD3/抗CD19在体外介导T细胞对靶细胞具有较强的杀伤作用。

双功能抗体介导CIK细胞杀伤胃癌细胞的实验研究

目的初步探讨抗EGFR/抗CD3双功能抗体介导对于CIK细胞杀伤胃癌细胞MKN45及SGC7901能力的影响。方法通过化学耦联法合成抗EGFR/抗CD3双功能抗体并检验其双特异抗体功能。采用免疫细胞化学法明确靶细胞的EGFR表达情况。通过细胞结合率检测及MTT杀伤实验检测抗EGFR/抗CD3双功能抗体介导CIK细胞与胃癌细胞结合及杀伤的能力,并与单纯CIK细胞、单纯EGFR单抗和/或CD3单抗介导CIK细胞的结合及杀伤作用比较。结果抗EGFR/抗CD3双功能抗体介导CIK细胞与胃癌细胞株MKN45及SGC7901结合率分别为(64.6±7.2)%和(59.5±6.1)%,显著高于其余各对照组(P<0.05),对照组间无显著性差异;MTT细胞杀伤实验结果提示:抗EGFR/抗CD3双功能抗体介导CIK细胞对胃癌细胞株杀伤率显著高于单纯抗CD3单抗介导及抗CD3单抗联合抗EGFR单抗介导组,而后两组杀伤率又显著高于单纯抗EGFR单抗介导组及单纯CIK细胞组(P<0.05)。结论体外实验初步显示抗EGFR/抗CD3双功能抗体介导可显著提高CIK细胞的对胃癌细胞的结合及杀伤能力。

抗皂角毒、表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究

目的：研究制备抗皂角毒和表皮生长因子受体双功能抗体，用以导向皂角毒杀伤肿瘤细胞。方法：在制备ＥＱ７５、ＣＹ１２．１４单克隆抗体细胞株的基础上，通过杂交杂交瘤技术制备双功能抗体细胞株。结果：双功能抗体（ＥＱ７５×ＣＹ１２．１４）与单用皂角毒杀伤肿瘤细胞（Ａ４３１）的ＩＣ５０分别为１０－９．６、１０－８．４ｍｏｌ／Ｌ。结论：双功能抗体（ＥＱ７５×ＣＹ１２．１４）杀伤肿瘤细胞（Ａ４３１），以ＩＣ５０值计算，有效率为单用皂角毒的１５倍左右。

抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子的构建

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体 ,用PCR方法克隆大肠杆菌碱性磷酸酶基因 ,通过酶切分析和DNA序列测定核实后 ,将其重组到抗乙肝表面抗原 (HBsAg)Fab段的Fd羧基端 ,构建重组融合蛋白表达载体pHBFAP ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷诱导表达后 ,采用ELISA法检测到培养上清中存在与HBsAg的结合活性和碱性磷酸酶的催化活性 ,显示抗HBsAg 碱性磷酸酶双功能抗体分子在大肠杆菌中获得了表达 .

抗CD_3/抗CD_(20)微型双功能抗体裸鼠体内分布研究

目的：建立裸鼠皮下人Ｂ－淋巴细胞移植瘤模型，研究抗ＣＤ３／ＣＤ２０。微型双功能抗体在裸鼠体内的分布。方法：采用亲和层析分离纯化本室构建的抗 ＣＤ３／抗 ＣＤ２０微型双功能抗体可溶性表达产物，并用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、分子排阻层析和 ＦＡＣＳ鉴定纯化产物；采用５周龄左右的雌性 ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ，经４Ｇｙ照射、皮下接种 Ｒａｊｉ细胞建立裸鼠皮下人Ｂ－淋巴细胞移植瘤模型，并于眼底静脉丛注射１２５Ｉ标记的抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０微型双功能抗体，测定各组织中１２５Ｉ的分布。结果：雌性ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ经照射、皮下接种１×１０～７～３×１０～７Ｒａｊｉ细胞／只，６～１４天均开始出现移植瘤，移植瘤细胞膜表面标记与 Ｒａｊｉ相同，且在２４小时时肿瘤部位１２５ Ｉ的分布明显低于心、肝、肾、脾，其比值分别为０．０８、０．１９、０．０６和０．５１，而 ７２小时时肿瘤部位１２５Ｉ的分布则高于心、肝、肾、脾，其比值分别为 ２．３２、９．４６、８．２４和９．５０。结论：抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０微型双功能抗体能在裸鼠皮下人Ｂ－淋巴细胞移植瘤部位富集，是一个有望用于Ｂ细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体。

抗人喉癌/抗VEGF双功能抗体制备及应用研究

目的:研制抗人喉癌/抗血管内皮因子(VEGF)双功能克隆抗体,用于喉癌抗血管生成治疗。方法:采用二次杂交瘤技术制备抗人喉癌/抗VEGF双功能抗体。经酶联免疫吸附试验法和SP法检测喉癌及癌前病患者血清及癌组织中VEGF的含量表达。结果:获得6株分泌抗人喉癌/抗VEGF双功能抗体的杂交瘤,经免疫组化证实与喉癌细胞特异性结合率为93%,而与血管内皮细胞结合率为89%。血清中VEGF含量表达,喉癌组与癌前病组及正常对照组相比差异均显著。IgG亚型鉴定为IgG2aBSAb抗体效价为1∶25600倍(ELISA法)。结论:二次杂交瘤法制备的双功能抗体具有均匀性、可控性、效价高、稳定性好,可用于喉癌抗血管生成治疗,动态检测可作为判断喉癌预后的客观指标。

抗人膀胱癌双功能抗体对荷瘤鼠的免疫治疗

目的 :建立抗人膀胱癌双功能抗体对荷人膀胱癌小鼠主动免疫的模型。方法 :采用抗人膀胱癌双功能抗体免疫 BALB/C小鼠 ,对照组采用生理盐水。免疫 3次后 ,于末次免疫后 1周 ,将新鲜的人膀胱移行细胞癌组织移植于小鼠肾包膜下 ,移植后第 2、4、6、8和 1 0天处死小鼠 ,取血清进行抗双功能抗体分析。移植瘤行组织学检查 ,观察宿主淋巴细胞浸润情况及瘤细胞可见率。结果 :实验组小鼠肾脏包膜下人膀胱癌细胞很快受到排斥 ,在移植后第 6天 ,淋巴细胞浸润即达高峰 ,而对照组在第 1 0天淋巴细胞浸润才达高峰 ;实验组在移植后第 6天瘤细胞可见率即明显降低 ,而对照组呈逐渐下降趋势 ;实验组抗双功能抗体为阳性 ,对照组为阴性。结论 :抗人膀胱癌双功能抗体作为抗原免疫小鼠后 ,能够排斥小鼠体内人膀胱癌细胞的生长。

抗人膀胱癌双功能抗体的临床应用

目的 :研究抗人膀胱癌双功能抗体的主动免疫治疗作用 ,为临床应用提供理论依据。方法 :用抗人膀胱癌双功能抗体主动免疫治疗膀胱癌病人 ,同时用生理盐水注射作为对照组 ,检测血清中人抗鼠抗体的产生情况、治疗前后各项体液免疫指标及 NK细胞活性变化。结果 :与对照组相比 ,治疗组病人的免疫指标上升。结论 :抗人膀胱癌双功能抗体有增强免疫力的作用 。

化学交联的抗TNF和抗CALLA双功能抗体的制备及其导向功能研究

本文探索了用抗 CALLA 和抗 TNF 的双功能抗体导向 TNF 杀伤 CALLA 阳性白血病细胞的可行性.用化学交联剂 SPDP 制备了抗 TNF 和抗 CALLA 抗体的交联物,经鉴定为双功能抗体;与 TNF 联合使用,在 CALLA 阳性白血病细胞系 nalm—6上进行体外杀伤实验。MTT 比色法测定杀伤效果。我们发现经双功能抗体导向后,nalm—6细胞对 TNF 的敏感性明显增加。

抗人膀胱癌双功能抗体的制备与鉴定

目的 :制备抗人膀胱癌双功能抗体 ( Bf Ab)并进行体外实验与鉴定。方法 :提取膀胱癌抗原 ,应用膀胱癌抗原通过杂交瘤技术制备抗人膀胱癌单克隆抗体 ,后者经胃蛋白酶水解后制备抗人膀胱癌单克隆抗体的 F( ab′) 2 片段。然后将该片段通过二次杂交制备杂交瘤 ,用其免疫新西兰白兔 ,血清经凝胶纯化后获抗人膀胱癌 Bf Ab,应用 ELISA和免疫组化方法进行鉴别。结果 :抗人膀胱癌 Bf Ab与抗人膀胱癌单克隆抗体呈阳性反应 ,与 BALB/C小鼠 γ球蛋白呈阴性反应 ;Bf Ab可以同时结合靶细胞的肿瘤抗原和效应细胞表面的触发分子 ,引发正常细胞对肿瘤细胞的防御机制。结论 :Bf Ab既能竞争性地与膀胱移行细胞癌抗原结合 ,又具有激活淋巴细胞的功能 。

抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体的高密度发酵与纯化

在发酵罐上采用高密度发酵的方法对抗CD3ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体工程菌进行了培养,其发酵结果是每升发酵液的湿菌菌重150g,OD550值达121;以免疫亲和层析的方法纯化抗CD3ScFv/抗PgPScFv双功能抗体,经计算抗体产量可达146.6mg/L;间接免疫荧光测定结果经流式细胞仪分析计算表明,抗CD3ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合。

抗EGFR/抗CD3双功能抗体对胃癌荷瘤小鼠的免疫治疗研究

目的通过抗EGFR/抗CD3双功能抗体(EGFR/CD3 BsAb)治疗SGC7901胃癌细胞移植瘤小鼠模型,初步验证该抗体在体内对胃癌细胞的杀伤能力。方法采取化学偶联法合成的EGFR/CD3 BsAb联合人外周血淋巴细胞(PBLS)经尾静脉给药注入荷SGC7901胃癌细胞移植瘤小鼠体内。实验裸鼠随机分为抗EGFR单抗联合PBLS组(抗EGFR组)、抗CD3单抗联合PBLS组(抗CD3组)、EGFR/CD3 BsAb联合PBLS组(EGFR/CD3 BsAb组)和空白对照组(生理盐水组)。治疗后检测并比较加药各组对胃癌细胞的杀伤能力。结果 EGFR/CD3 BsAb成功制备,分子量为43kD。EGFR/CD3 BsAb组裸鼠的肿瘤抑制率为(57.2±8.6)%,显著高于抗EGFR组的(38.5±6.1)%和抗CD3组的(6.9±7.6)%(P<0.05);治疗结束时EGFR/CD3 BsAb组的瘤重为(517.1±45.4)mg,显著低于抗EGFR组的(737.4±54.3)mg和抗CD3组的(1097.9±167.7)mg(P<0.05)。各组移植瘤组织EGFR免疫组化染色均为强阳性。EGFR/CD3 BsAb组裸鼠肿瘤组织CD3免疫组化染色可见部分细胞呈阳性。透射电镜观察显示,EGFR/CD3 BsAb组和抗EGFR组可见肿瘤坏死。结论 EGFR/CD3 BsAb在体内条件下可能对胃癌有治疗作用。

抗CD_3/抗TNP双功能抗体的制备及对胃癌细胞系的杀伤作用

:目的 以化学方法将抗CD3 及抗三硝基苯 (TNP)单克隆抗体交联为双功能抗体 ,研究此双功能抗体与任何TNP化的抗肿瘤单抗结合 ,介导对肿瘤细胞的杀伤作用。方法 分别纯化抗CD3 及抗TNP单克隆抗体 ,经二硫苏糖醇 (DTT)还原、偶联得到抗CD3 /抗TNP双抗。TNP化抗胃癌单抗PD4 、3H11与抗CD3 /抗TNP双抗介导人淋巴细胞对胃癌细胞系MGC80 3的细胞毒作用。结果 双抗与TNP化的单抗结合 ,介导效应细胞对靶细胞的杀伤率高于未TNP化单抗 ,并随着效靶比的提高而升高。结论 抗CD3 /抗TNP双抗能够与不同种类的TNP化单抗结合介导效应细胞杀伤靶细胞 。

抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性

目的 用携带分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv TNF α)的重组逆转录病毒感染T细胞淋巴瘤Hut 78细胞 ,使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv TNF α融合蛋白 ,观察转导的T细胞对体外培养肝癌细胞的杀伤作用 .方法 用感染性重组病毒产生细胞C2 2 (PA317/PST)产生的病毒上清转导人T细胞淋巴瘤Hut 78细胞 ,采用PCR、RT PCR、细胞原位杂交及免疫组织化学染色等方法 ,对转导的Hut 78细胞进行DNA、mRNA及蛋白水平的分析 .转导的Hut 78细胞分别与SMMC 772 1、HHCC共培养 ,MTT法检测Hut/PST细胞表达产物对两种肝癌细胞的杀伤作用 .结果 PCR、RT PCR结果显示转导Hut细胞中扩增出外源目的基因对应的电泳条带 .neo基因探针原位杂交显示转导细胞质内有较强的紫蓝色阳性反应信号 ,其阳性率约为 95 % .鼠抗人TNF α多克隆抗体免疫组织化学染色 ,转导细胞质内有明确的棕黄色阳性反应信号 .MTT法检测结果 ,分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养的两种肝癌细胞的杀伤率分别为 15 .4 %和2 6 .5 % .结论 分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在T细胞中整合并稳定表达 ,其分泌的表达产物对两种肝癌细胞均具有一定的亲合活性 ,并且具有一定的体外杀伤作用 .

抗HBS-碱性磷酸酶双功能抗体的分析及试用

抗ＨＢＳ－碱性磷酸酶双功能抗体的分析及试用①１０００３７北京海军总医院高荣凯王琰刘克金化冰朱迎春刘群英陈宇萍关键词肝炎表面抗原，乙型；碱性磷酸酶；双功能抗体中国图书资料分类号Ｒ４４６．６１酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）在对微量抗原或抗体的检测中具有重...