基于HRM技术开发水稻糊化温度基因ALK功能标记

【目的】糊化温度是影响稻米蒸煮食味品质的重要指标,ALK是控制水稻糊化温度的主效基因,开发可快速高通量鉴定ALK基因型的功能标记有助于提高水稻品质改良的效率。【方法】根据ALK基因4198位、4329位和4330位存在的单碱基差异,设计基于HRM技术检测的基因功能标记。【结果】通过PCR检测结合测序分析,筛选了ALK基因2个功能区域的功能标记ALKH4、ALKH5。利用ALKH4、ALKH5对81份籼稻品种、279份粳稻品种进行了ALK基因型检测,结果发现,16份粳稻和19份籼稻为G-GC基因型;51份粳稻为A-GC基因型;212份粳稻和62份籼稻为G-TT基因型。【结论】基于HRM技术开发的基因功能标记ALKH4、ALKH5可以快速高通量鉴定控制糊化温度ALK不同基因型,具有重要的应用价值。

小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A17的功能标记开发

籽粒大小是影响小麦产量的重要因素之一。为了开发小麦籽粒大小相关的功能标记,本研究克隆得到一个潜在籽粒大小相关基因TaCYP78A17,并对其进行了系统进化、表达模式、等位变异分析和功能标记开发。结果表明,TaCYP78A17基因是小麦细胞色素P450 CYP78A家族的一员,且在小麦幼穗和籽粒中高表达;在30份普通小麦品种中发现TaCYP78A17-Ap存在6个SNP和2个InDel;根据InDel 4和InDel 8开发功能标记InDel-A17,可将30份普通小麦品种分为TaCYP78A17-Ap-HapⅠ, TaCYP78A17-Ap-HapⅡ和TaCYP78A17-Ap-HapⅢ三种单倍型;利用该功能标记在323份普通小麦品种中进行验证,发现该功能标记可以有效区分上述3种单倍型;表型调查发现具有TaCYP78A17-Ap-HapI单倍型的小麦其千粒重和籽粒大小显著高于具有TaCYP78A17-Ap-HapⅡ或TaCYP78A17-Ap-HapⅢ单倍型的小麦。研究结果有望应用于小麦分子标记辅助选择育种。

小麦淀粉合成关键基因TaAGPL1功能标记的开发

淀粉约占小麦籽粒干重的70%,是粒重的决定因子,TaAGPL1基因编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的胞质型大亚基,在小麦淀粉合成中发挥着关键作用。在近年来审定的239份小麦品种中,TaAGPL1基因序列中仅B拷贝上存在13个单核苷酸多态性位点(SNPs),根据序列多态性将小麦品种分成2种单倍型(Hap1和Hap2),将单倍型与千粒重进行相关分析发现,Hap2为优异单倍型;根据编码域1944位点A/C碱基突变,开发了酶切扩增多态性序列(CAPS)功能标记;对Hap1和Hap2品种间TaAGPL1-1B基因转录水平和AGPase酶活性进行测定,发现它们在灌浆后14和21 d的Hap2小麦籽粒中均显著提高。研究结果为现代高淀粉含量或高千粒重小麦品种的筛选和创制提供理论基础和筛选依据。

玉米籽粒功能标记研究进展

功能标记是依据功能基因序列的多态性开发的一种准确、高效的分子标记,不同等位变异基因与表型直接相关。籽粒性状是由互相关联多基因调控的较复杂的重要性状之一,也是生化生理一系列过程的最终表现,已成为育种者在品种选育过程中的研究热点。对国内外玉米籽粒性状的分子标记、QTL定位、候选基因克隆、全基因组关联分析、转基因技术等应用的相关研究进行了综述,探讨了籽粒功能标记存在的问题,旨在为玉米籽粒分子生物学及现代生物技术在玉米育种中的应用提供参考。

一种水稻香味基因功能标记的开发

为了提高水稻香味基因的分子标记辅助选择的准确性,根据水稻隐性香型品种与非香型品种的BAD2基因(即香味基因)序列之间存在8bp碱基缺失,设计出香味基因fgr的InDel功能标记GRFM04。利用该标记对粤丰B(香型)/振丰B(非香型)的F2分离群体和其他16份香稻品种和6份非香稻品种进行检测验证。依据其PCR扩增产物电泳带型,可以准确地区分出香型纯合基因型、非香型纯合基因型和杂合基因型3种带型,且3种带型与其植株或品种相应的香味性状表现完全呈一一对应关系。

稻瘟病抗病基因Pi-k^h功能标记的开发及江苏粳稻品种中Pi-k^h的变异

稻瘟病抗病基因Pi-kh是对稻瘟病菌具有广谱抗性的一个重要基因。根据Pi-kh感病基因和抗病基因序列存在143bp插入的特征,设计了InDel标记FM143。Tetep具有抗病基因Pi-kh,分子标记FM143PCR扩增带型为非插入带型,而不携带Pi-kh的材料的带型为插入带型。利用该标记对Tetep与宁9108的F2群体进行分析,结果表明该标记能准确区分Pi-kh、Pi-kh纯合及杂合基因型,标记基因型符合1∶2∶1比例,没有发生偏分离现象。利用该标记对65份江苏省历年来大面积推广的粳稻品种和64份粳稻品系进行检测,筛选出具有非插入带型的粳稻品种19份、粳稻品系22份。进一步对江苏省粳稻品种中Pi-kh位点进行测序,发现江苏粳稻品种(系)Pi-kh基因座位与Tetep和已经登录的Pi-kh序列相比在102bp处存在一个单碱基的变异(由G突变为C),使得谷氨酸变异为天门冬氨酸,且该变异高度保守。将江苏省粳稻品种中发现的Pi-kh位点的等位基因暂定名为Pi-khJSJ。

水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因ALS功能标记的开发与应用

选育和利用抗除草剂水稻品种具有重要的生产实践意义。通过筛选水稻资源,发现了抗除草剂材料金粳818,其ALS基因编码区第1880位碱基存在一个由G到A的碱基变异,导致丝氨酸突变为天冬酰胺,从而具有除草剂抗性。本研究基于该位点的碱基变异,设计了11条等位基因特异PCR(allelic-specific PCR,AS-PCR)引物,经过优化筛选,获得两个引物组合F1N(S1/S9)和F1M(S1/S10),将该标记命名为AS-ALS。利用F2群体及其亲本和杂交种,结合AS-ALS标记检测和除草剂抗性分析,结果表明感除草剂ALS-G等位基因型只能被F1N引物对有效扩增,抗除草剂ALS-A等位基因型只能被F1M引物对有效扩增,而杂合基因型能同时被两对引物F1N和F1M扩增,ALS-A纯合或杂合等位基因型都表现抗除草剂,ALS-G纯合基因型表现感除草剂。因此本研究开发的标记能有效区分除草剂抗性基因的3种基因型,基因型与表型完全对应。该标记用于回交育种,可以选择ALS-A杂合基因型单株,剔除ALS-G纯合等位基因型,在自交的F2保留ALS-A纯合基因型单株,连续自交,能快速获得除草剂抗性稳定的水稻材料。该除草剂抗性基因的功能标记还可用于咪唑啉酮类除草剂抗性资源筛选。

水稻广亲和基因S5-n的功能标记开发及其应用

广亲和基因S5-n是能够恢复籼、粳杂种育性的基因,利用常规育种方法回交转育广亲和基因需要通过配组杂种F1,根据F1的育性判断和选择S5-n,选育周期长,方法繁琐。因此,在广亲和遗传改良和聚合育种中需要寻找一种快速、简便的广亲和基因检测方法。本研究根据水稻广亲和基因和籼粳S-5等位基因序列存在136bp缺失的特征,设计了InDel标记S5136。前人研究已经明确02428、Dualr、CPSLO17具有S5-n,分子标记S5136 PCR扩增这3个材料的带型为缺失带型,而不携带广亲和基因S5-n的材料的带型为非缺失带型。利用该标记对3037与02428的F2群体分析表明,该标记能准确区分S5-n、S5-i纯合及杂合基因型,标记基因型符合1∶2∶1比例,没有发生偏分离现象。利用该标记从554份水稻品种资源(O.sativa L.)和27份普通野生稻(O.rufipogen Griff.)以及24份江淮流域杂草稻资源中筛选出具有缺失带型的资源材料13份,并对其PCR产物测序证实为S5-n,对Kasalath的广亲和性进行了初步验证;从20份02428的高世代育种材料中,筛选到携带广亲和基因S5-n的恢复系2份。该标记可以用于S5-n基因资源筛选、分子标记辅助选择育种和培矮64S为母本的杂交种种子纯度鉴定。

小麦粒重基因TaCwi-A1功能标记CWI22、CWI21的验证及应用

【目的】验证已开发的TaCwi-A1功能标记CWI22、CWI21检测小麦千粒重的可靠性,为分子标记辅助选择提供参考信息。同时用该标记检测新疆小麦品种资源,探讨TaCwi-A1等位变异类型及分布频率。【方法】首先以110份新疆冬小麦品种资源为材料,用CWI22、CWI21检测TaCwi-A1基因型,并利用SKCS测定千粒重,比较TaCwi-A1a、TaCwi-A1b基因型品种间千粒重的差异。再以1 241份新疆小麦品种资源为材料,对TaCwi-A1基因型进行分子标记检测。【结果】在110份新疆冬小麦品种资源中,有46份材料能够用CWI22扩增出402 bp的目的片段,说明含有TaCwi-A1a;有64份材料能够用CWI21扩增出404 bp的目的片段,说明含有TaCwi-A1b;并且TaCwi-A1a基因型品种(系)的千粒重(43.5 g)显著高于TaCwi-A1b(40.9 g)(P<0.05)。1 241份新疆小麦品种资源中,TaCwi-A1a的分布频率为62.6%,TaCwi-A1b为37.4%。其中,冬小麦中TaCwi-A1a的分布频率为63.0%,TaCwi-A1b为37.0%;春小麦中TaCwi-A1a的分布频率为61.7%,TaCwi-A1b为38.3%,并且TaCwi-A1a在不同类型冬、春小麦品种资源中的分布频率大小顺序均为国外品种(系)>国内品种(系)>自育品系>审定品种>地方品种;新疆小麦审定品种中,冬小麦TaCwi-A1a的分布频率为40.0%,TaCwi-A1b为60.0%,春小麦TaCwi-A1a的分布频率为68.6%,TaCwi-A1b为31.4%。在1990年以前、1991—2000年、2001年以后3个阶段的审定品种中,TaCwi-A1a和TaCwi-A1b的分布频率分别为11.1%和88.9%、50.0%和50.0%、69.2%和30.8%。【结论】TaCwi-A1的分子标记CWI22、CWI21能够较好地区分小麦千粒重的大小,可用于粒重的分子标记辅助选择。在新疆小麦品种资源中,TaCwi-A1a有较高的分布频率。其中,冬小麦品种资源中的分布频率略高于春小麦品种资源,引进品种(系)高于自育品种(系),自育品种(系)高于地方品种。在地方品种和自育品种(系)中,TaCwi-A1a在春小麦中的分布频率明显高于冬小麦,说明新疆冬、春小麦育种对粒重的选择存在一定的差异;但总体都有较强的选择压力,使TaCwi-A1a在审定品种中的分布频率逐渐提高。

水稻千粒重基因TGW6功能标记的开发与利用

水稻粒重是影响产量及品质的重要性状之一,TGW6是能显著增加千粒重同时不影响稻米品质的粒重基因。为提高千粒重基因TGW6在育种中的选择效率,在前人克隆的基础上,根据TGW6与其等位基因tgw6在功能区域存在的单碱基缺失,设计和筛选出TGW6基因的功能标记CAPs6-1,对CAPs6-1扩增的PCR产物测序验证,说明CAPs6-1可以准确鉴定出TGW6的不同基因型。利用该标记对不同来源的43份籼稻资源、江苏2007-2013年审定的65份粳稻品种和太湖流域179份粳稻地方资源进行了TGW6基因型检测,筛选到携带TGW6基因的籼稻资源14份,244份粳型资源均不携带TGW6基因,这也说明TGW6主要分布在籼型水稻资源中,在粳型资源中几乎不存在。

水稻稻瘟病抗性基因Bsr-d1功能标记的开发和利用

稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一,选育抗病品种是防治该病害最有效的方法。Bsr-d1是对稻瘟病菌具有广谱抗性的一个重要基因。为提高Bsr-d1基因在育种中的选择效率,根据Bsr-d1与其感病等位基因bsr-d1在功能区域存在的单核苷酸差异,设计和筛选出Bsr-d1基因不同类型的基因功能标记CAPs5-1和3Bsr-d1/3bsr-d1,结合测序分析验证,可准确鉴定出Bsr-d1的不同基因型。利用3Bsr-d1/3bsr-d1对34份籼稻品种、江苏历年来主要推广的110份粳稻品种、其他省份的13份粳稻品种、148份太湖流域地方粳稻资源和19份太湖流域地方籼稻资源进行了Bsr-d1基因型检测,筛选到携带Bsr-d1基因的籼型资源11份,271份粳型资源中均不携带Bsr-d1基因,这也说明Bsr-d1主要分布在籼型水稻资源中,在粳型资源中几乎不存在。本研究为Bsr-d1基因的育种利用和分子标记辅助选择奠定了基础。

水稻冷胁迫响应基因OsSADMC功能标记的开发和利用

通过对95份水稻种质资源进行苗期耐冷性鉴定,筛选出10份苗期耐冷(存活率≥60%)和9份冷敏感的材料(存活率为零),并对水稻冷胁迫响应基因OsSADMC进行了表达分析,发现对照和冷胁迫处理条件下该基因在耐冷品种中的表达量都显著高于冷敏感品种。对耐冷材料丽江新团黑谷(LTH)和冷敏感材料IR29的基因编码区域进行了克隆和测序分析,在两个品种间鉴定了10个SNP位点,其中第749碱基处存在的一个碱基变异(C突变为T),从而使丝氨酸变为亮氨酸。根据其中一个SNP位点设计了OsSADMC的功能标记SADMC-CAPS1,该标记可以准确地鉴定出19份耐冷性不同水稻种质资源OsSADMC的基因型和耐冷性。

水稻多酚氧化酶基因功能标记的开发与应用

水稻酚反应是水稻分类的重要依据。控制水稻酚反应的多酚氧化酶基因(PPO)已经克隆,根据其等位基因的DNA序列差异设计了InDel功能标记FMppo-18和FMppo-29。利用这两个标记对45份材料进行了标记基因型分析和酚反应鉴定。结果发现3份普通野生稻为非缺失带型;8份籼稻材料中6份为非缺失带型,而Dular为缺失29 bp带型,龙晴为缺失18bp带型,表明Dular和龙晴分别携带29 bp和18 bp缺失的PPO等位基因;11份粳稻材料中9份携带18 bp缺失的PPO等位基因,2份携带29 bp缺失的PPO等位基因。对23份杂草稻鉴定的结果表明,7份早年发现的杂草稻,即3份江苏省连云港穞稻和4份安徽省怀远、来安、全椒、肥东的塘稻为非缺失带型;而16份近年来发现的杂草稻中14份不缺失,2份表现为18 bp缺失的PPO等位基因,与江苏省大面积推广的栽培粳稻品种携带相同的PPO基因。酚反应结果表明带29 bp或18bp缺失的PPO等位基因的材料酚反应呈阴性,而不缺失的材料酚反应呈阳性。标记基因型与酚反应表现型完全对应。表明这两个功能标记可用于水稻种质资源鉴定、进化研究以及多酚氧化酶基因的分子标记辅助选择育种。

水稻广谱抗稻瘟病基因PigmR功能标记的开发及应用

【目的】稻瘟病是世界上最严重的水稻病害之一。通过功能标记的开发,为加快广谱持久抗稻瘟病基因PigmR在水稻育种中的应用提供依据。【方法】利用Snapgene 2.3.2软件分析PigmR的碱基变异特征,用Oligo7设计特异功能标记。为了避免因PCR扩增失败引起的假阴性,设计扩增内参基因Actin1的引物作为参照,对功能标记进行优化。用功能标记对水稻亲本材料、丽江新团黑谷的单基因系材料、育种中间材料和南粳53045/谷梅4号BC1F3群体株系进行鉴定。稻瘟病鉴定的供试菌株为江苏省稻瘟病代表菌株(2018-4、2018-65、2018^(-1)02、2018-222和2018-241)的混合菌。将供试菌株移植RCA培养基上,25℃培养7 d,用黑光灯照射72 h,待稻瘟病菌产生孢子后,再用无菌水洗下,配成10×10倍显微镜下每视野30—40个孢子的悬浮液。于水稻抽穗前3—4 d注射混合菌株,每穗注射1 mL菌液,做好标记。在水稻灌浆饱满后进行抗性调查。【结果】根据PigmR与PigmS、Pigm-R4序列比对及差异分析,设计了8对分子标记引物。通过分子检测,筛选获得的PigmR功能标记GMR-3,能特异扩增来源于谷梅4号的PigmR,获得98 bp产物,而不携带PigmR扩增不出产物。以不同浓度配比优化GMR-3与内参基因Actin1检测引物Actin1^(-1),发现以0.4μmol·L^(-1) GMR-3与0.1μmol·L^(-1) Actin1^(-1)组合浓度扩增出PigmR和Actin1特征条带的效率相当,效果最优,将该标记命名为GMRA。用该标记扩增水稻样品,携带PigmR的样品能扩增出146和98 bp条带,不携带PigmR的样品仅能扩增出146 bp条带。利用GMRA标记检测229份水稻材料,只有谷梅4号能扩增出146和98 bp条带,其他籼稻和粳稻均只能扩增出146 bp条带。进一步对29份丽江新团黑谷的单基因系材料进行检测发现,GMRA标记能有效区分PigmR与Pi9、Piz、Piz-t等同源性较高的基因,有很好的特异性。利用GMRA标记,从240份育种中间材料中筛选到3份携带PigmR的材料,可作为该基因的供体材料。利用该标记进行分子标记辅助选择,将PigmR通过回交转育到优质食味粳稻南粳53045。对南粳53045/谷梅4号BC1F3群体单株进行分子标记检测及稻瘟病人工接种鉴定,发现携带PigmR的单株均表现为抗或中抗,不携带PigmR的单株均表现为高感,表明导入PigmR能显著改良南粳53045的穗颈瘟抗性。【结论】PigmR的功能标记能有效用于抗稻瘟病遗传改良和资源筛选。

功能标记的开发及在禾谷类作物中的应用

功能标记是根据与表型紧密相关的功能基因内部特定区域多态性基序开发出来的一种新型分子标记。由于功能标记直接来源于基因内部的功能性基序,因此,此类标记可以对不同遗传背景下目标等位基因的有无作直接、快速的判定。本文在3种DNA分子标记基于植物中的开发、应用特点比较论述的基础上,重点介绍了功能标记的开发特点,最后探讨功能标记作为一种辅助育种手段在禾谷类作物常规育种中的应用及其开发前景。

利用功能标记鉴定普通野生稻中的白叶枯病抗性基因

以9个菲律宾白叶枯病菌小种对供试的9份普通野生稻(Oryza rufipogonGriff.)及1份高感白叶枯病材料IR24进行抗性鉴定,发现IR24对所有的菌株都表现为高感,6份野生稻材料对9个菌株表现全抗,占参试野生稻总数的67%。取自广西玉林的1份材料只感PXO280(P8),海南万宁的1份材料感PXO71(P4),广州高州的1份材料对PXO79、PXO99和PXO339感病,而这几份材料对其余菌株都表现为抗病,说明每份材料至少含有1个抗性基因。利用已克隆的白叶枯病抗性基因xa5、xa13、Xa21和Xa27的功能标记检测,结果表明9份供试普通野生稻中都不含抗性基因xa5、Xa21;5份为显性Xa13纯合体,4份为隐性抗病xa13杂合体;5份为抗病显性Xa27纯合体,3份为隐性xa27纯合体,1份材料中xa27和Xa27都不存在。

功能标记及在品种鉴定和辅助育种中的应用前景

功能标记是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发出来的一种新型分子标记。由于来自基因内的功能性基序,此类标记不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下确定目标等位基因的有无。本文详细描述了功能标记的概念及与其它几种类型遗传标记相比存在的优势;提出了功能标记开发的基本条件和发展策略。利用关联分析方法和近等基因系途径可以获得直接或间接的功能标记。结合本单位的研究方向,探讨了功能标记在分子标记辅助育种和品种鉴定中的应用潜力和开展相关工作的一些设想。

豫南香稻品种Badh2基因功能标记的检测及应用

【目的】香稻中香味的产生是由于水稻第8染色体上面Badh2基因的功能缺失而导致2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)前体物质的增多,进而2AP积累使稻米产生香气。【方法】本研究利用Badh2基因开发的7个功能标记,针对豫南地区16份香稻品种进行了检测与分析。【结果】4份香稻品种属于第2外显子突变类型,2份香稻品种属于第4~5外显子突变类型,5份香稻品种属于第7外显子突变类型;并没有发现Badh2基因启动子区及第12~14外显子突变类型的香稻品种。【结论】通过Badh2基因功能标记的检测与分析,本研究鉴定了豫南香稻品种对应的突变类型,为利用分子标记辅助选择培育优质香稻新品种奠定基础。

水稻紫色果皮的延迟遗传及Pb基因功能标记开发

以香血糯(紫色果皮)、02428(白色果皮)及以它们为亲本的衍生世代F1、F2和F3为材料,研究紫色果皮的遗传特征;根据已克隆的紫色果皮Pb与白色果皮pb等位基因第7外显子的差异,设计酶切扩增片段长度多态性标记(CAPS),分析标记基因型;选取10份材料PCR产物进行测序分析。结果表明,以白色果皮02428为母本时,F1的果皮颜色为白色,而以紫色果皮香血糯为母本时,杂交种F1的果皮颜色为紫色;正反交F1植株所结F2种子果皮都为紫色,没有分离;F2植株所结F3种子果皮颜色发生分离,符合3∶1分离比例;CAPS标记分析结果表明紫色果皮基因能被切开,而紫色颖壳基因不能切开,测序结果说明紫色果皮材料相对于白色果皮材料在第7外显子存在GT缺失。因此,水稻紫色果皮是单基因控制的显性遗传,由母体基因型决定,是典型的延迟遗传;紫色果皮与紫色颖壳由不同基因控制;紫色果皮基因的CAPS分子标记可以作为紫米育种的基因功能标记。

小麦生长素结合基因TaABP1-D的克隆、功能标记开发及其与株高的关联

生长素在植物生长发育过程中通过建立浓度梯度来调控植物的株型。ABP1(auxin binding protein)作为生长素受体,在质膜上相关生长素响应活动中起重要作用。本研究从普通小麦中国春基因组数据库中分离了TaABP1基因的基因组序列,根据基因组间序列差异将TaABP1定位于小麦第5同源群。在中国春中克隆得到TaABP1-D基因的gDNA和cDNA序列。TaABP1-D基因的开放阅读框为1887bp,编码205个氨基酸,含有ABP1蛋白典型的内质网滞留信号KDEL及Box区域。表达分析表明,TaABP1-D在普通小麦中国春拔节期的根、茎基部、茎上部和叶尖均有表达,相对表达量为叶尖>茎上部>根>茎基部,与小麦的株型发育关系密切。系统发育分析表明,ABP1基因在植物中较为保守,TaABP1-D是水稻OsABP1的直向同源基因。针对TaABP1-D基因上游调控区重复序列差异(GT)6/5开发了一个SSR标记,该标记在W7984×Opata85重组自交系(RIL)群体中对株高的表型变异解释率为9.7%,是一个与株高极显著关联的功能标记;其中对应高秆类型的等位变异属野生种特有,在栽培种中被淘汰,推测TaABP1-D基因在小麦驯化过程中可能经历了瓶颈效应。