B族链球菌C5a肽酶功能活性区域的分段表达

目的表达B族链球菌C5a肽酶蛋白功能活性区域,为进一步研究及开发疫苗奠定基础。方法设计引物,从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出含有C5a肽酶蛋白不同功能区域基因的4个目的片段,分别插入T载体,再经酶切后,插入原核表达载体PET32a,进行融合表达。对表达蛋白进行免疫原性检测,并通过镍柱大量纯化。结果成功构建4个目的片段的PET表达质粒。经SDS-PAGE检测表达的融合蛋白相对分子质量分别为80000、78000、70000和36000。蛋白质谱分析证实,表达的4个蛋白为B族链球菌C5a肽酶蛋白的可能性分数分别为82、152、113和79。免疫印迹证实均能与特异性抗C5a肽酶蛋白的抗体反应,纯化后的蛋白SDS-PAGE纯度达90%。结论已成功地表达了可溶性C5a肽酶蛋白4个功能活性区域,为蛋白免疫表位和毒力机制的研究以及亚单位蛋白疫苗的制备奠定了基础。

EB病毒LMP1-CTAR3对NP69细胞增殖和蛋白质表达的影响

为了探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)第三个功能活性区域(CTAR3)在鼻咽上皮细胞NP69中的转化作用机制,采用逆病毒感染的方法,将浓缩的逆病毒RV-LMP1和RV-LMP1△232～351分别感染鼻咽上皮细胞NP69,建立NP69-LMP1与NP69-LMP1△232～351稳定表达细胞系.通过绘制生长曲线、平皿克隆形成试验和软琼脂集落形成试验比较野生型和突变型LMP1对NP69细胞增殖的影响,运用蛋白质组学方法鉴定NP69-LMP1与NP69-LMP1△232～351细胞间的差异表达蛋白,选用实时荧光定量RT-PCR与Western blot对其中部分蛋白质点差异表达进行验证.结果发现:a.突变型LMP1△232～351促NP69细胞增殖的能力较野生型LMP1明显降低(n=3,P<0.05);b.鉴定了LMP1-CTAR3在NP69细胞中参与调节的16个蛋白质(表达上调的蛋白质8个,下调的8个).c.实时荧光定量RT-PCR和Westernblot证实了部分上述蛋白质的差异表达.以上结果说明,LMP1-CTAR3是其发挥促细胞增殖的重要活性部位,可能通过参与调节G蛋白和异柠檬酸脱氢酶等蛋白质的表达而起作用.