利用电转化法构建烟草野火病菌的Tn5插入突变体

采用电转化法将含有kanr基因标记的EZ::Tn5转座子插入到烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci)的基因组中.结果表明,在电压为2 400 V条件下,供试的烟草野火病菌菌株SMX 006及WT4的电转化效率分别为0.8×103,4.2×103cfu.μg-1DNA.转化电压下降至1 800 V时,WT4菌株的转化效率也随之下降至1.64×103cfu.μg-1DNA.对转化子进行kanr筛选以及特异性PCR鉴定,表明Tn 5可以稳定地插入到受体菌的基因组中.对烟草野火病菌SMX 006的Tn 5插入突变体进行了多次致病性、运动性和胞外蛋白酶活性测定,从中获得了2个致病力明显减弱的突变株(H028,H029)、1个运动能力明显减弱的突变株(H028)、1个运动能力丧失的突变株(H029)、1个产胞外蛋白酶能力明显减弱的突变株(H046),以及1个胞外蛋白酶缺失的突变株(H045).

雄激素受体基因各功能域片段的原核表达与功能鉴定

目的系统构建雄激素受体(AR)野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒,Western blot与凝胶迁移(EMSA)实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法基于pGEX-4T-1载体,构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达重组质粒。应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行诱导表达,确定各重组蛋白的最佳参数。分别用AR内源性抗体和GST标签抗体进行Western blot鉴定,分析诱导前、诱导后细菌裂解液中的目的蛋白,并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化。将纯化后蛋白与病毒荧光探针进行孵育,复合物于非变性凝胶中电泳检测纯化蛋白功能。结果成功构建了AR全长和3个功能域截短体的原核表达质粒。PCR和双酶切鉴定均显示在各插入片段大小相符处出现阳性条带,且测序结果与NCBI GenBank标准株比对一致。其中,96 ku GST-AR-NTD+DBD与86 ku GST-AR-NTD两个融合蛋白得以成功表达及后续纯化。纯化蛋白可与病毒基因组DNA直接结合。结论来源同一基因序列的AR截短体重组质粒原核表达条件不同,纯化后的AR蛋白可用于深入了解AR各功能域与其他分子间的直接相互作用机制。

胁迫诱导谷胱甘肽还原酶活性和同工酶谱的变化与H_2O_2的关系(英文)

以多种胁迫处理的野生型水稻中花11及其携带谷胱甘肽转移酶(GST)和过氧化氢酶(CAT)的功能获得突变体为材料,分析地上部H2O2含量、谷胱甘肽还原酶(GR)活性和同工酶谱的变化.结果显示,胁迫条件下野生型水稻(W)中H2O2的含量明显高于其突变体(M).非胁迫条件下W和M的GR同工酶都有3条带,且W和M之间无显著差异.单一镉、PEG-6000和外源H2O2处理诱导W均产生1条额外谱带,用H2O2和抗坏血酸(AsA)同时处理时,W中则未见该条带.当用镉和CAT抑制剂复合处理时,W和M的所有同工酶活性都降低;而同时用镉和H2O2清除剂处理时,W中则无GR同工酶条带.在其他处理(盐、高温、Zn、盐+高温、镉+高温、PEG+高温和Cd+Zn)条件下,W和M的GR活性和/或同工酶谱的变化也有明显差别.在所有处理中,W和M的GR总酶活性的变化与其同工酶的活性变化基本一致.在胁迫条件下W和M积累H2O2的水平不同,其GR活性和/或同工酶谱的变化也存在明显差异.研究表明,不同环境胁迫诱导水稻GR活性和同工酶谱的变化可能与H2O2水平有关.

错配修复蛋白MutS的新功能位点

MutS蛋白是DNA错配修复系统的关键成份,其突变会使细胞失去正常的错配修复功能,导致基因组不稳定和细胞异常.本研究利用易错PCR随机突变和利福平筛选,建立了研究MutS蛋白的新方法,发现影响MutS错配修复功能的新位点,并利用表面等离子共振、分子筛、farwestern等方法对错配修复功能缺陷的突变体进行了活性测定和分析;通过揭示MutS与错配修复功能相关的新信息,为MutS同源物多态性的研究及人源MutS同源物突变与癌症相关的研究提供新的线索.

水稻靶标基因单碱基定向替换技术的建立

目前CRISPR/Cas9技术作为一种基因组定点编辑技术已经被广泛应用于不同植物中,但是对于实现特定碱基替换仍具有很大难度.本研究将APOBEC1和UGI与Cas9n融合,开发了一种包含rBE3和rBE4的高效技术,并通过该技术对OsSERK1,OsSERK2,ipa1,pi-ta和OsBRI1等基因的靶位点碱基进行编辑.在T0代转基因植物中rBE3/sgRNA将胞嘧啶碱基转换为所有其他核苷酸碱基中效率高达38.9%;利用rBE4还获得了抗稻瘟基因pi-ta的隐性等位基因靶位点胞嘧啶碱基替换为胸腺嘧啶碱基,编辑效率达18.2%.此外,在所检测的材料中,并未检测到由Cas9n切口酶引起的InDel事件.这些结果表明,rBE3和rBE4技术的开发,在未来植物基础研究和农业应用中具有广阔的前景.