黄色瘤胃球菌双功能酶xynD基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征

[目的]黄色瘤胃球菌xynD基因编码葡聚糖酶和木聚糖酶2个独立的催化结构域。本研究在毕赤酵母中导入xynD基因,表达蛋白并对其酶活性及酶学性质进行研究。[方法]根据毕赤酵母的密码子偏爱性对xynD基因优化(优化后的基因命名为xynDm),构建重组质粒pPIC9K-xynDm,转化至毕赤酵母GS115,通过筛选获得基因工程菌株GS115-pPIC9K-xynDm,经诱导表达获得重组XynDm,再对其酶学性质进行初步研究。[结果]XynDm的木聚糖酶与葡聚糖酶在36和72 h酶活性和比活性均达到最大值,分别为265.32、468.36 IU·mg^(-1)和2260.87、3208.31 IU·mg^(-1)。XynDm的木聚糖酶活性在温度37~40℃、pH值为4.5~6.5时较稳定,最适酶活性温度和pH值分别为37℃和6.0,对4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖、高黏度阿拉伯木聚糖和桦木木聚糖有良好的水解作用;XynDm的葡聚糖酶活性在温度40~55℃、pH值为5.0~9.0时较稳定,最适酶活性温度和pH值分别为55℃和6.0,对大麦β-葡聚糖有水解作用。XynDm双功能酶活性被Cu^(2+)、Zn^(2+)和Co^(2+)激发,Ag^(+)和SDS使其酶活性几乎丧失。[结论]XynDm木聚糖酶和葡聚糖酶的最适底物分别为4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖和大麦β-葡聚糖,最适温度分别为37和55℃,最适pH值均为6.0。

传统发酵食品中功能酶的研究进展

传统发酵食品是通过微生物发酵产生各种各样的功能酶和丰富风味物质的食品。发酵食品的生产过程不断富集丰富的酶资源,如何对这些功能酶体系进行系统和科学的研究是当前的研究热点。本文整理了传统分离培养对发酵食品中功能酶的研究,发现该方法能研究其中关键功能酶的酶活。重点整理了近年来基于16S rRNA和ITS测序的PICRUSt分析、宏基因组、宏转录组和宏蛋白组等高通量技术对发酵食品功能酶的研究,发现单一高通量技术相对传统筛选培养技术能获取更多的功能酶信息、解析复杂的酶代谢通路及识别活跃的功能酶。还整理了多种高通量技术组合对功能酶的研究,发现不同手段获取的信息能更深入全面地解析食品的发酵过程。也发现有研究者在高通量技术分析基础上,通过异源表达进行传统食品的具体功能酶的研究。本文全面总结了各种传统发酵食品中功能酶系的研究结果和方法近况,旨在为传统发酵食品的功能酶研究与应用提供技术参考。

氨基酸转氨/脱羧双功能酶克隆表达、功能鉴定及其机理研究

大肠杆菌来源的L-天冬氨酸转氨酶(L-AspAT)是一种具有严格立体选择性、高效一步合成特性的生物催化剂,研究该酶对于手性胺化合物的生物合成至关重要。该研究将野生大肠杆菌来源的L-天冬氨酸转氨酶基因克隆表达至大肠杆菌工程菌BL21(DE3)中高效表达、分离纯化出该酶,并对该酶催化的反应进行功能鉴定。结果表明该酶是一种具有催化氨基酸转氨和二羧酸底物非氧化脱羧2种催化能力的双功能酶,该研究对其催化的2种反应酶学性质分别进行了研究,同时对酶催化机理进行了探讨。检测反应液中底物和产物的浓度随时间的变化,发现反应体系中先进行转氨反应,待反应液中脱羧底物浓度足够多时才开始进行脱羧反应,脱羧反应同时又促进转氨反应,2种反应相互影响,互相促进。同时将L-AspAT分别与转氨和脱羧的底物小分子对接,结果显示,L-天冬氨酸转氨酶对于谷氨酸和酮戊二酸而言,对接获得的结合位点是不同的,该双功能酶存在2个催化活性中心用来催化不同的反应。实验发现转氨反应的最适温度为35℃,脱羧反应的最适温度为37℃。2种反应的最适pH均为8,5 mmol/L的Cu^(2+)和Mg^(2+)能够促进转氨反应,5 mmol/L的Ni^(2+)能够促进脱羧反应。

基于多功能酶的高效生物酶电池系统的构建与性能研究

随着能源需求的增长和对可再生能源的追求,生物酶电池作为一种新兴的能源转换技术受到了广泛关注。多功能酶是一类具有多种催化活性的酶,其在构建高效生物酶电池系统中具有重要的作用。本文综述了基于多功能酶的高效生物酶电池系统的构建与性能研究,包括多功能酶的筛选与优化、酶电极的设计与制备、电池系统的性能评价等方面的内容。通过对相关研究的归纳与总结,得出了一些重要的结论,为进一步优化和应用多功能酶电池系统提供了有益的参考。

血清总胆汁酸与传统肝功能酶学指标在肝胆疾病中的诊断效果对比

探讨肝胆疾病诊断中,测定血清总胆汁酸、传统肝功能酶学指标的价值。方法以2022.01至2022.10为研究日期,选取急性肝炎患者、肝硬化患者、肝癌患者、健康体检者各35例,分别作为不同的组别。所有受检者均接受血清总胆汁酸、传统肝功能酶学指标检验。评析各组指标情况、检出阳性率。结果 (1)急性肝炎组TBA、ALT、AST、ALP、GGT各为(106.01±12.65)μmol/L、(361.07±13.15)U/L、(197.51±12.24)U/L、(97.95±4.84)U/L、(68.01±3.85)U/L,健康对照组各指标为(6.01±1.23)μmol/L、(20.01±1.23)U/L、(6.96±1.37)U/L、(74.89±5.37)U/L、(23.02±3.18)U/L,组间差异存在,P<0.05。(2)各组TBA阳性率高于其他传统肝功能酶学指标检出阳性率,P<0.05。结论 血清总胆汁酸、传统肝功能酶学指标诊断肝胆疾病均具有显著的价值,与后者相比,前者的诊断效能更高。具体应用中,可采取联合检测的形式,从而降低疾病漏诊、误诊的风险。

1163例非酒精性脂肪性肝病患者体质类型分布特点及其与体重指数、血脂及肝功能酶学的关系

目的探讨非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)体质类型分布特点及其与体重指数(BMI)、血脂及肝功能酶学等的关系。方法 2008年1—12月,对诊断为NAFLD的1163例患者进行中医体质分型,并观察其与体重指数、血脂及肝功能酶学的关系。结果 1163例NAFLD患者中,痰湿质371例,气虚质401例,占全部病例的66.38%。痰湿质患者的BMI、血脂(TC、TG、LDL-C)、肝功能酶学(ALT、AST、GGT)水平较其他体质类型患者均明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论痰湿质和气虚质是NAFLD发病的主要体质类型;痰湿质较其他体质类型更易出现体重指数异常、血脂异常及肝功能酶学异常。

阿牙克库木湖嗜盐菌的分离及功能酶的筛选

从新疆阿尔金山国家自然保护区阿牙克库木湖采集的泥样和水样中,分离培养了90株嗜盐菌,其中多数为中度和极端嗜盐菌,颜色以红色和白色为主,细胞形态多为杆状、球状,97%呈革兰氏阴性,研究结果表明该湖有着丰富的嗜盐微生物资源.对分离菌株进行了几种重要工业用酶的筛选,发现其中淀粉酶产生菌有4株,菌株AJ225和AJ243淀粉酶活性较高;蛋白酶产生菌有7株;脂肪酶生产菌有13株,菌株AJ238和AJ265具有较高的酶产量;在分离菌株中未检测到纤维素酶和木聚糖酶活性.

广西茅尾海红树林土壤放线菌多样性及功能酶活性研究

研究广西茅尾海红树林自然保护区内红树林土壤中可培养放线菌的多样性,挖掘具有高产多种功能酶活性的放线菌类群。应用可培养技术和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析研究红树林土壤中可培养放线菌的多样性;并以10种酶活底物为指示物,结合点植法和透明圈法对可培养的放线菌进行功能酶活性筛选。结果显示,从红树林土壤中共分离到444株放线菌,隶属于6目13科24属63种,其中3株放线菌为潜在新种。从63株不同种的放线菌中筛选出56株放线菌在至少1种功能酶活性检测中显示阳性,总阳性率为88.89%;其中具有2种以上功能酶活性的放线菌31株,链霉菌属、微杆菌属和短小杆菌属的产酶菌株最为丰富。综上所述,广西茅尾海红树林自然保护区内红树林土壤中可培养放线菌的种类丰富多样,潜藏着放线菌新资源,且功能酶活性显著,具有较大的挖掘潜力。

速冻方式对番木瓜浆功能酶活力冻藏稳定性的影响

以鲜榨番木瓜浆为材料,研究不同速冻方式对番木瓜浆的功能酶活力冻藏稳定性的影响。采用-40℃液浸式速冻机和-40℃超低温冰箱对比,分别测定其冻结曲线,分析液浸式速冻和空气对流冻结对番木瓜浆-18℃冻藏过程中木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶、脂肪酶比活力的变化。结果表明:采用-40℃液浸式速冻的番木瓜浆中心温度通过最大冰晶生成区的速度比-40℃空气对流冻结方式快8.2倍,冻结速度对冻藏期间番木瓜浆中功能酶活力的保持有显著影响;番木瓜浆采用液浸式速冻,-18℃冻藏90d,能较好保持功能酶活力。

浓香型白酒大曲在发酵和成熟过程中主要功能酶活力分析

为了对浓香型白酒大曲中功能酶系进行深入研究,实验根据大曲制作、发酵与成熟工艺流程,选取10个时间节点的大曲样品,分析曲皮和曲心α-淀粉酶、单宁酶、木聚糖酶和脂肪酶活力及变化规律。结果显示,在进入发酵期后,曲皮中α-淀粉酶活力基本在523.28~765.78 U范围内变化波动;曲心α-淀粉酶活力在曲块发酵期升降变化波动较大,而在成熟期后期基本维持在350 U左右。在整个研究期内,曲皮和曲心单宁酶活力变化规律较为相似,均先迅速升高,后火期达到最大,然后缓慢降低;木聚糖酶活力在曲皮和曲心样品中,都呈现出持续上升至养曲阶段达到最大值(119.72 U和113.70 U)后再下降的趋势;与其它酶相比较,脂肪酶活力在曲皮和曲心中的变化趋势差异较大,其中曲皮脂肪酶活力呈现先升高再降低,再次升高后降低的变化,而曲心中脂肪酶活力则是持续升高至贮藏一个月达到最大(597.50 U)后急剧下降,然后再次缓慢升高的变化规律。针对白酒大曲发酵和成熟过程中主要功能酶活力变化规律的考察,将为高产酶微生物的分离和筛选提供表征性指导作用,同时也将为制曲工艺的改良和加强型特种大曲的研制提供基础数据。

舟山地区抗Mn^(2+)、Cr^(6+)和产功能酶嗜盐菌的筛选

以浙江舟山地区近海和盐田样品中分离纯化的120株嗜盐菌为材料,筛选产功能酶的菌株,发现其中淀粉酶产生菌有8株,蛋白酶产生菌有5株,脂肪酶产生菌有23株,其中HS238和HS225产量较高,在分离菌株中未检测到纤维素酶活性.选取其中13株进行金属敏感性实验,结果显示菌株HS223,HS239,HS254可以抗2mg·mL-1Mn2+,所有菌株都耐受培养基中10μg·mL-1Cr6+,但没有筛选到产表面活性剂的菌株.

NAFLD患者中医证候类型与血脂、肝功能酶学、血清瘦素及胰岛素抵抗指数的关系

目的探讨非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中医证候类型及其与血脂、肝功能酶学、血清瘦素以及胰岛素抵抗指数等的关系,以更好地指导NAFLD的辨证论治。方法对诊断为NAFLD的576例患者进行中医证候分型,并观察其证型与血脂、肝功能酶学、血清瘦素及胰岛素抵抗指数的关系。结果 576例NAFLD患者中,脾肾阳虚证202例,肝郁脾虚证218例,占全部病例的72.9%。脾肾阳虚证患者的血脂(TC、TG、LDL)、肝功能酶学(ALT、AST、GGT)水平、血清瘦素以及胰岛素抵抗指数较其他证候类型患者明显增高,HDL则明显低于其他证候类型。结论脾肾阳虚证和肝郁脾虚证可能是广西地区NAFLD发病的主要体质类型;脾肾阳虚证患者较其他证候类型更易出现血脂、肝功能酶学、血清瘦素以及胰岛素抵抗指数异常;脾肾阳虚可能是NAFLD发病的关键脏腑病机。

焦碳酸二乙酯及碳二亚胺对纤维素酶-壳聚糖酶双功能酶的修饰作用

应用化学修饰剂焦碳酸二乙酯(DEPC)、碳二亚胺(EDC)对纤维酶-壳聚糖酶双功能酶(CCBE)进行修饰。结果表明:DEPC对CCBE中组氨酸残基的修饰研究显示,每摩尔酶分子的水解壳聚糖及纤维素的活性中心仅需约1mol组氨酸残基参与;盐酸羟胺的脱羧基作用结果表明,盐酸羟胺能使CCBE的两种酶活力恢复到相似的水平,证明了组氨酸是CCBE两种酶活力的活性中心氨基酸残基,且同一个组氨酸残基是CCBE两种酶活性中心氨基酸;EDC对天门冬氨酶/谷氨酸残基的化学修饰研究表明,每摩尔CCBE的两种活性中心均需1mol天门冬氨酶/谷氨酸残基参与。

纤维素酶中双功能酶水解壳聚糖作用方式的研究

采用HPLC、HPLC-MS及TLC等方法,研究了从纤维素酶中分离得到的既具有纤维素酶活又具有壳聚糖酶活———双功能酶的水解壳聚糖的专一性。通过对氨基低聚糖(GlcN)n、乙酰氨基低聚糖(GlcNAc)n标样及壳聚糖的双功能酶水解进程及水解产物分析,表明该双功能酶能水解(GlcN)n,而不能水解(GlcNAc)n,即它能水解GlcN-GlcN之间的-β1,4糖苷键,但不能水解GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键。不同脱乙酰度壳聚糖经酶水解,其产物大部分为单糖,壳聚糖脱乙酰度(DD)对水解反应产物的形成和反应速率影响较小,表明该酶也可作用于GlcN-GlcNAc之间的-β1,4糖苷键。运用Time-Course分析法对双功能酶水解壳四糖(GlcN)4的进程进行分析,表明其作用方式为外切,推测此双功能酶为一外切氨基葡萄糖苷酶。

色氨酸残基在双功能酶CCBE中的作用

应用化学修饰剂NBS对从绿色木霉生产的纤维素酶中分离出的既具有壳聚糖酶活性又具有纤维素酶活性的单一组分(简称双功能酶CCBE)进行了修饰。结果表明,CCBE的壳聚酶活性中心需一分子色氨酸残基,CMCase活性中心需两分子色氨酸残基;底物保护作用及酶解动力学研究表明,CCBE的壳聚酶活性中心及CMCase活性中心的一分子的色氨酸残基位于底物结合部位,而CMCase活性中另一分子色氨酸残基位于催化结构中心。

黄花蒿法呢基焦磷酸合酶、紫穗槐二烯合酶双功能酶基因的构建、原核表达与功能鉴定

试验将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶(法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶)的基因进行融合,经大肠杆菌表达后鉴定其融合蛋白的功能。结果表明:融合蛋白具有了双功能酶活性。双功能酶基因的构建,为进一步将双功能酶基因转入黄花蒿,提高青蒿素含量奠定了基础。

绿色木霉非专一性产双功能酶的鉴定

[目的]对绿色木霉诱导产生的具有壳聚糖和纤维素降解活性的双功能酶组分CCBEⅡ进行酶学性质研究和酶类鉴定。[方法]采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定CCBEⅡ的壳聚糖酶和纤维素酶活力,对酶的温度、pH值稳定性、底物特异性、金属离子影响等酶学性质进行研究。[结果]双功能酶CCBEⅡ作用壳聚糖和羧甲基纤维素钠(CMC)的最适温度均为60℃,最适作用pH值分别为5.2和4.2。金属离子Mn2+、Mg2+对酶的2种活性都有激活作用,Fe3+、Cu2+、Ag+和Hg2+则能强烈抑制2种酶活。CCBEⅡ对CMC和壳聚糖(84%脱乙酰度)显示出相当的降解活力,而对对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷无降解活性;以二糖方式切割CMC,而以单糖形式切割壳聚糖,可以水解GlcN-GlcN和GlcNAc-GlcN键或GlcN-GlcNAc键。经鉴定,CCBEⅡ与糖苷水解酶7族的绿色木霉所产的CBHⅠ(gi|295937)序列具有很高的同源性,二级结构以β-折叠为主。[结论]双功能酶CCBEⅡ与从商品纤维素酶制剂中纯化的双功能酶性质基本一致,两者为同一蛋白;经鉴定实际为具有外切壳聚糖酶活性的CBHⅠ,属于糖苷水解酶7族。

双功能酶水解壳聚糖和纤维素的活性中心研究

运用同一种酶具有两种及其以上酶活力时其活性中心个数的判定方法,对从纤维素酶中分离出的既具有壳聚糖酶活力又具有纤维素酶活力的双功能酶CCBE的活性中心个数进行了研究,结果表明:CCBE系运用同一活性中心催化水解两种不同底物。

极耐热双功能酶的表达纯化及性质研究

将含海栖热袍菌（Thermoga maritima）β-木糖苷酶（Xyl）基因的重组质粒p ET-28a-xyl导入大肠杆菌BL21-Codon Plus（DE3）-RIL中,经诱导实现高效表达,经热处理和Ni2＋亲和层析纯化达到电泳均一,并对纯化的重组酶Xyl的酶学性质进行研究。结果表明,重组Xyl同时具有木糖苷酶和阿拉伯糖酶活性,即为双功能酶。以对硝基苯酚-ɑ-阿拉伯呋喃糖苷（p NPAF）作为底物,重组酶Xyl的最适作用温度和最适p H分别为80～90℃和5.8,90℃的半衰期为1.0 h,在pH 7.0～7.8区间重组酶保持较高的稳定性。金属离子Mn2＋对重组Xyl的双活性有促进作用,而Cu2＋和SDS对酶的抑制作用最明显。重组Xyl能将低聚木糖中的木二糖和木三糖彻底分解为木糖。

过氧物酶体多功能酶2中固醇载体蛋白2结构域的功能

过氧物酶体多功能酶 (包括Ⅰ型、Ⅱ型 ,简称MFE1、MFE2 )在哺乳类动物的脂类代谢中发挥其重要作用 .MFE1具有 2 烯酰CoA水合酶 1和 (3S) 羟脂酰CoA脱氢酶的活性 ,而MFE2具有 2 烯酰CoA水合酶 2和 (3R) 羟脂酰CoA脱氢酶的活性 ,两者均催化烯酰CoA在过氧物酶体β 氧化途径中的第 2步和第 3步反应 .MFE1与MFE2的氨基酸序列不具有任何同源性 ,并且它们的底物特异性也不相同 .比较哺乳类MFE1及酵母MFE2发现 ,哺乳类MFE2羧基末端带有由 12 5个残基组成的固醇载体蛋白 2 (简称SCP2 )结构域 ,其功能是未知的 .为了研究SCP2结构域在MFE2中的功能 ,将人MFE2、MFE2ΔSCP2 (删除MFE2中的SCP2 )、脱氢酶结构域、水合酶结构域以及SCP2结构域分别在E .coli中表达 ,并经纯化得到相应的重组蛋白 .通过测定 2 烯酰CoA水合酶 2和 (3R) 羟脂酰CoA脱氢酶对烯酰CoA的催化活性发现 ,带有SCP2结构域的重组蛋白的酶活力及催化效率高于删除SCP2的突变体蛋白 .实验结果表明 ,SCP2结构域可能通过增强MFE2与脂酰CoA的结合力 。