加味丹玄口康调控口腔黏膜下纤维化大鼠Wnt/β-catenin信号通路机制研究

目的:探讨加味丹玄口康调控口腔黏膜下纤维化大鼠Wnt/β-catenin信号通路表达作用机制。方法:从35只SPF级成年雄鼠中随机挑选5只作为正常组,剩余30只大鼠采用槟榔提取物建模,成功建立25只口腔黏膜下纤维化(OSF)大鼠模型。将25只OSF模型大鼠随机分为OSF模型组、加味丹玄口康低剂量组、加味丹玄口康中剂量组、加味丹玄口康高剂量组和Wnt抑制剂组,每组各5只。加味丹玄口康低剂量组、加味丹玄口康中剂量组、加味丹玄口康高剂量组大鼠分别给予4、8、12 ml/kg加味丹玄口康灌胃,Wnt抑制剂组大鼠给予25 mg/kg的KYA1797K腹腔注射,OSF模型组和正常组大鼠给予4 ml/kg的0.9%氯化钠溶液灌胃。1次/d,持续给药4周。分别于治疗前、治疗2周、治疗4周比较各组大鼠张口度和颊黏膜评分。给药4周后处死大鼠,采用PCR和Western blot分别检测Wnt-1、β-catenin、Cylin D1和Axin基因及蛋白表达情况。结果:治疗2周及治疗4周后,Wnt抑制剂组、加味丹玄口康中剂量组、加味丹玄口康高剂量组大鼠的张口度增大,颊黏膜评分减小,加味丹玄口康高剂量组大鼠的张口度最大、颊黏膜评分最低,差异有统计学意义(均P<0.05);且以上各组大鼠张口度和颊黏膜评分与正常组比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。加味丹玄口康高剂量组与OSF模型组、加味丹玄口康低剂量组、加味丹玄口康中剂量组、Wnt抑制剂组比较,Wnt-1、β-catenin、Cylin D1 mRNA和蛋白表达水平降低,Axin mRNA和蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(均P<0.05)。加味丹玄口康高剂量组Wnt-1、β-catenin、Cylin D1和Axin基因及蛋白表达与正常组比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:加味丹玄口康可有效改善OSF模型大鼠临床症状,通过抑制Wnt/β-catenin信号通路相关基因及蛋白表达,抑制大鼠口腔黏膜纤维化。

加味丹玄口康对口腔黏膜下纤维化大鼠免疫细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及IFN-γ水平的影响

目的观察加味丹玄口康对口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis,OSF)大鼠血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平的影响,进一步验证加味丹玄口康治疗OSF的疗效机制。方法60只雄性SD大鼠随机均分为5组(正常组、模型组及加味丹玄口康低、中、高剂量组)。正常组自然饲养,其余4组采用颊黏膜下注入槟榔提取物(areca nut extract,ANE)后再用自制刷蘸ANE刷颊黏膜的方法造模8周。加味丹玄口康高、中、低剂量组通过灌服4、8、12 g/kg剂量的加味丹玄口康进行干预,模型组灌以10 mL/(kg·d)蒸馏水,均连续8周。实验结束后测定大鼠开口度,采用HE染法观察各组大鼠口腔颊黏膜病理形态,采用ELISA法检测各组大鼠血清中LDH、TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ水平。结果与正常组比较,模型组大鼠颊黏膜出现明显的纤维化表现,张口度和血清IFN-γ水平降低(P<0.05),血清LDH、TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,加味丹玄口康高、中、低剂量组张口度、血清IFN-γ水平均升高(P<0.05),血清LDH、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05)。与加味丹玄口康低剂量组比较,加味丹玄口康中剂量组血清IFN-γ水平升高(P<0.05),血清LDH、IL-1β、IL-6降低(P<0.05),加味丹玄口康高剂量组张口度和血清IFN-γ水平升高(P<0.05),血清LDH、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05)。与加味丹玄口康中剂量组比较,加味丹玄口康高剂量组张口度和血清IFN-γ水平均明显升高(P<0.05),血清LDH、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低(P<0.05)。OSF大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平与张口度均呈高度负相关,与血清LDH水平呈高度正相关(P<0.01),血清IFN-γ水平与张口度呈高度正相关,与血清LDH水平呈负相关(P<0.01)。结论加味丹玄口康能通过降低促纤维化免疫因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌,增加抑制纤维化免疫因子IFN-γ的分泌,影响机体免疫功能,并能增加张口度及降低OSF生物标志物LDH水平,进而改善口腔黏膜下纤维化,控制OSF病情进展。

加味丹玄口康通过Axin1调节口腔上皮损伤细胞增殖活性

目的探究加味丹玄口康(DXKK)对口腔上皮损伤细胞增殖活性的影响及轴抑制蛋白1(axis inhibition protein 1,Axin1)的作用。方法选取不同干扰位点的Axin1干扰小RNA-1(small interfering RNA-1,siRNA-1)、Axin1 siRNA-2和Axin1 siRNA-3干预口腔上皮细胞,qRT-PCR检测Axin1的基因表达水平来筛选Axin1的有效干扰靶点。将细胞随机分为空白对照组、干扰对照组、Axin1干扰组、过表达对照组和Axin1过表达组,采用qRT-PCR检测Axin1 mRNA的表达水平,采用细胞计数试剂盒和平板克隆检测细胞增殖情况,采用流式分析检测细胞周期水平,采用Western blot检测Axin1、β-catenin、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白的表达。采用氢溴酸槟榔碱(arecoline hydrobromide,AH)诱导口腔上皮细胞损伤模型,将口腔上皮细胞随机分为空白对照组、AH刺激组(50μg/mL)、空白血清干预组(10%空白血清+50μg/mL AH)、含DXKK血清干预组(10%含DXKK血清+50μg/mL AH)、含DXKK血清干预+Axin1过表达组(10%含DXKK血清+Axin1过表达质粒+50μg/mL AH),EdU染色检测口腔上皮细胞的增殖活性。结果与干扰对照组比较,Axin1干扰-1组、Axin1干扰-2组和Axin1干扰-3组Axin1的基因表达水平均显著降低(P<0.01);Axin1干扰组细胞增殖活性和β-catenin、PCNA、Bcl-2蛋白表达均显著升高(P<0.01),Axin1、Bax、cleaved Caspase-3蛋白和Axin1 mRNA的表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与过表达对照组相比,Axin1过表达组处于G1期的细胞比例、细胞增殖活性和β-catenin、PCNA、Bcl-2蛋白表达均显著降低(P<0.01),处于S期的细胞比例和Axin1、Bax、cleaved Caspase-3蛋白及Axin1 mRNA的表达均显著升高(P<0.01)。与空白对照组比较,AH刺激组Axin1蛋白表达显著增加(P<0.01),细胞增殖活性显著降低(P<0.01)。与空白血清干预组比较,含DXKK血清干预组Axin1蛋白表达需显著降低(P<0.01),细胞增殖活性显著升高(P<0.01)。与含DXKK血清干预组比较,含DXKK血清干预+Axin1过表达组细胞增殖活性显著降低(P<0.05)。结论Axin1可调控口腔上皮细胞增殖活性。DXKK通过抑制Axin1信号,促进AH诱导的口腔上皮细胞增殖。

加味丹玄口康对大鼠口腔黏膜下纤维化及其自噬水平的影响

目的探讨加味丹玄口康对大鼠口腔黏膜下纤维化(OSF)及其自噬水平的影响。方法选取SPF级SD雄性大鼠24只(180~200 g,4~8周龄),采用随机数字表法将其分为空白组、模型组和加味丹玄口康组,每组8只。模型组和加味丹玄口康组在大鼠双侧颊黏膜组织注射槟榔碱0.2 ml(10 mg/ml),1次/2 d,同时每天使用小牙刷沾取适量槟榔碱均匀施力刷大鼠双侧颊黏膜,持续8周,观察到大鼠颊黏膜出现白色病变确认造模成功,空白组不做干预。造模成功后,加味丹玄口康组以8 ml/(kg·d)加味丹玄口康灌胃,空白组和模型组灌胃等量0.9%氯化钠溶液,三组均灌胃4周。实验后取三组双侧颊黏膜进行苏木精-伊红染色和Masson染色观察病理变化和胶原纤维沉积情况,透射电镜观察三组自噬小体数量。采用免疫组织化学染色检测三组上皮钙黏素和微管相关蛋白轻链3(LC3)阳性细胞表达情况;Western blot检测上皮钙黏素、LC3-Ⅱ和选择性自噬接头蛋白p62的表达;RT-PCR检测LC3-Ⅱ和p62 mRNA表达。结果模型组口腔黏膜上皮明显萎缩,胶原纤维显著变粗、增多,上皮层变薄,黏膜下层胶原纤维大量沉积,加味丹玄口康组口腔黏膜上皮层较厚,胶原纤维减少,上皮层萎缩程度减轻。模型组自噬小体数量低于空白组,上皮钙黏素、LC3阳性细胞数低于空白组,上皮钙黏素、LC3-Ⅱ蛋白表达低于空白组,LC3-ⅡmRNA表达低于空白组,p62蛋白及其mRNA表达高于空白组(P<0.05)。加味丹玄口康组自噬小体数量高于模型组,上皮钙黏素、LC3-Ⅱ阳性细胞数高于模型组,上皮钙黏素、LC3-Ⅱ蛋白表达高于模型组,LC3-ⅡmRNA表达高于模型组,p62蛋白及其mRNA表达低于模型组(P<0.05)。结论加味丹玄口康可改善大鼠OSF,可能与其自噬水平一定程度升高有关。

加味丹玄口康对口腔黏膜下纤维化中上皮间质转化的调控研究

目的研究加味丹玄口康对口腔黏膜下纤维化(OSF)中上皮间质转化(EMT)的调控作用及其基于微小RNA(miR)-4725-3p(MIR)/分泌型卷曲相关蛋白4(SFRP4)信号通路的调控机制。方法收集OSF和正常口腔黏膜组织。用槟榔碱刺激人永生化表皮细胞HaCaT模拟OSF细胞模型,并用加味丹玄口康治疗。再用MIR模拟物、MIR抑制剂、MIR阴性对照(NC)分别干预槟榔碱组和加味丹玄口康+槟榔碱组的细胞。分别检测MIR、SFRP4以及纤维化和EMT相关蛋白上皮钙粘蛋白、波形蛋白、细胞角蛋白19的表达,以及MIR和SFRP4的互作关系。结果与正常口腔黏膜组相比,OSF组中MIR表达下调,SFRP4表达上调;MIR对SFRP4起负调控作用。细胞实验中,用槟榔碱构建OSF模型成功;加味丹玄口康处理后MIR、细胞角蛋白19、上皮钙粘蛋白的表达升高,而SFRP4和波形蛋白表达降低;与加味丹玄口康+MIR NC处理组相比,加味丹玄口康+MIR抑制剂组的指标呈现相反的趋势。结论加味丹玄口康可通过调控MIR/SFRP4轴抑制OSF中的上皮间质转化。

加味丹玄口康对槟榔碱诱导的HUVECs细胞内皮间充质转化的影响

目的基于氧化应激介导的内皮间充质转化(EndMT)探讨加味丹玄口康对槟榔碱诱导所致HUVECs细胞损伤的保护机制。方法参照文献方法复制槟榔碱诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型,实验设正常组、模型组、空白血清对照组和加味丹玄口康含药血清组。采用CCK-8法检测不同浓度的槟榔碱及加味丹玄口康含药血清对HUVECs细胞存活率的影响,细胞成像分析检测各组HUVECs细胞形态学变化,采用MitoSOX荧光探针检测线粒体活性氧(ROS),采用免疫荧光及激光共聚焦检测氧化应激相关蛋白PGC-1α、Nrf2及间充质转化标志物相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、SNAI1表达情况。结果加味丹玄口康能有效改善槟榔碱诱导所致HUVECs细胞损伤,提高细胞存活率(P<0.01),明显抑制细胞线粒体活性氧(ROS)异常升高(P<0.01),显著逆转氧化应激相关蛋白PGC-1α、Nrf2表达减少(P<0.01或P<0.05),同时上调细胞EndMT相关蛋白E-cadherin、下调EndMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin和SNAI1表达(P<0.01或P<0.05)。结论加味丹玄口康对槟榔碱诱导所致HUVECs细胞损伤具有的保护作用,其是通过抑制氧化应激介导的EndMT进而发挥抗槟榔碱损伤作用,这可能是加味丹玄口康抗槟榔碱所致的口腔黏膜下纤维化病变继而预防口腔癌的重要机制。