应用红外荧光和加尾引物法进行向日葵SSR遗传分析中的多聚PCR和多聚凝胶电泳的优化(英文)

在向日葵(Helianthus annuus L.)自交系SSR遗传分析中,为了提高SSR荧光分析效率、简化分析程序羊u降低研究费用,我们进行了多聚PCR和多聚凝胶电泳两项技术的优化研究。结果表明,优化多聚PCR和多聚凝胶电泳的影响因子(如逐步降低的退火温度的循环数、各个多聚位点引物浓度的平衡、PCR缓冲液浓度以及Taq DNA多聚酶的浓度等)可以收到更好的实验效果。基于以上的优化研究,系统地提出了一套优化的加尾引物法的策略。同时,提出了在多聚PCR和多聚凝胶电泳中常常遇到的技术难题的有效防止和解决的方法。

用5′加尾长引物进行AFLP片段的直接测序

现有的AFLP标记片段测序方法比较费时,成本也较高.设计一个包括EcoRI接头引物和5′端加36个额外核苷酸的长引物AF2SC,用该引物再扩增时可AFLP片段末端增加36个碱基.再利用这36个碱基的末端序列进行测序,只需一次反应就能获得AFLP标记片段的全序列.该方法缩短了AFLP片段测序所需时间,也降低了实验成本.

富含多糖的植物组织miRNA提取方法的改进

目的:建立冻融法结合小分子RNA分离试剂盒简便快速提取富含多糖的植物组织miRNA的方法。方法:利用乙醇/醋酸钾沉淀法、小分子RNA分离提取试剂盒标准步骤提取方法和结合反复冻融法改进的小分子RNA分离提取方法分别提取玉米胚乳组织小分子RNA,通过小分子RNA浓度、纯度及完整性检测,以及内参5s rRNA扩增验证模板真实性等比较3类方法小分子RNA的提取效果。结果:乙醇/醋酸钾沉淀法易丢失大量小分子RNA;小分子RNA分离提取试剂盒标准步骤提取所获小分子RNA浓度、纯度较低,富含大量多糖杂质;反复冻融法结合小分子RNA分离试剂盒提取的小分子RNA浓度、纯度较高,有效去除多糖杂质,内参5s rRNA扩增验证真实性表明其所获miRNA的cDNA模板质量较高。结论:结合反复冻融法和小分子RNA分离试剂盒,可以简便快速去除多糖内杂质,保证小分子RNA完整性,加尾及引物延伸RT-PCR、所获miRNA的cDNA模板质量较高,可用于后续miRNA实验研究。

少白细胞血小板miRNA提取方法

目的:建立常规梯度离心结合MACS磁珠分选纯化和小分子RNA分离试剂盒简便快速提取血小板miRNA的方法。方法:利用常规梯度离心获取血小板后,结合MACS磁珠分选和小分子RNA分离试剂盒提取少白细胞血小板(LDP)小分子RNA;经血小板计数、CD45和GPIIb mRNA marker PCR扩增检测,判定纯化效果;通过小分子RNA浓度、纯度及毛细管电泳完整性检测,以及内参U6和血小板miR-449b加尾及引物延伸RT-PCR后PCR扩增结果验证构建血小板miRNA的cDNA模板真实性。结果:提取小分子RNA纯度较高,有效去除白细胞污染,虽然含量较少,但内参U6和血小板miR-449b真实性验证结果提示,构建血小板miRNA的cDNA模板质量较高。结论:常规梯度离心结合MACS磁珠分选纯化和小分子RNA分离试剂盒,可有效去除白细胞污染,保证小分子RNA完整性,从而提取高质量血小板miRNA的cDNA模板,可用于后续血小板miRNA试验研究。

T-ARMS PCR多重检测方法研究

目的 建立有错配的加尾双引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(T-ARMS PCR)多重检测的方法,实现针对肝细胞癌常见基因突变位点TP53 R249S、TP53 R273H、CTNNB1 S45F的多重检测。方法 针对3个基因突变位点进行引物设计,每个基因突变位点所设计引物序列的5′端不加一段DNA序列(Tail Free Primer)或者所设计的引物序列5′端加一段相同的DNA序列(Tailed Primer),利用实时荧光定量PCR仪分别检测并比较3个基因突变位点的不同引物序列形成的单重体系、三重体系的扩增结果,研究T-AMRS PCR方法对突变型基因位点突变负荷的检测限、特异性和多靶标检测能力。结果 3个基因突变位点Tailed Primer单重体系扩增结果显示,突变型质粒的扩增均优于野生型质粒,野生型质粒的扩增均被有效抑制,突变负荷检测限低至0.10%,特异性良好。Tailed Primer三重体系减少了引物二聚体的产生,调控CTNNB1 S45F、TP53 R249S、TP53 R273H的解链温度分别为81.11℃、82.36℃、86.35℃,实现不同突变位点的显著区分。与Taqman探针基因分型方法相比,T-AMRS PCR方法野生型和突变型基因的Ct值差异更显著,单荧光通道即可实现突变基因检测。结论 运用T-ARMS PCR进行一管三重检测,分析熔解曲线,能有效检测到目的基因突变,抑制野生型模板的扩增,并区分不同的基因突变位点;同时,Tailed Primer设计减少了多重情况下引物二聚体的产生。该方法可为临床中肝细胞癌的早期筛查、预后预测、病情监测提供理论依据。