大鼠动物实验中的重复开放肾活检技术

基础性医学研究中经常会使用大鼠来建立模拟人类疾病的动物模型[1],但大鼠实验周期较长,模型建立往往需要花费大量的时间和精力。同时,随着对动物伦理问题的日益重视[2],如何在动物实验中减少动物的数量,优化实验动物的使用和充分利用获得的实验动物材料,是一个非常重要的问题。

柔肝灵颗粒对肝纤维化大鼠血清MMP-2及PDGF-BB影响的实验研究

目的:研究柔肝灵颗粒对四氯化碳(CC14)肝纤维化大鼠模型血清MMP-2和PDGF-BB含量的变化。方法:用40%四氯化碳制备大鼠肝纤维化模型,应用不同剂量柔肝灵颗粒进行干预,用大黄虫丸作为对照组。通过酶联免疫法检测血清中MMP-2和PDGF-BB的含量变化。结果:柔肝灵颗粒大剂量和中剂量组在降低肝纤维化大鼠血清指标MMP-2及PDGF-BB胶原含量方面,其效果优于大黄虫丸组(P<0.05)。结论:四氯化碳(CCL4)所致肝纤维化大鼠模型血清MMP-2及PDGF-BB含量显著增高,柔肝灵颗粒能减轻其含量。

参附注射液对缺血/再灌注损伤诱导大鼠心肌细胞凋亡的实验研究

目的:通过观察参附注射液对缺血/再灌注损伤时,心肌细胞超微结构及心肌细胞凋亡参数的影响,探讨参附注射液拮抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机制。方法:建立心肌缺血/再灌注损伤模型,结扎大鼠左冠状动脉前降支(LAD)30min,再灌注10min。将46只大鼠随机分为5组,(Ⅰ)假手术组;(Ⅱ)对照组心肌缺血30min+生理盐水;(Ⅲ)对照组心肌缺血30min/再灌注10min+生理盐水;(Ⅳ)给药组心肌缺血30min+参附注射液;(Ⅴ)给药组心肌缺血30min/再灌注10min+参附注射液。以上各组分别采集相同部位的心室肌组织;应用透射电镜观察心肌细胞超微结构,通过CIMAS多功能真彩色病理图像分析CIMAS系统对心肌细胞线粒体进行体视学分析。原位标记TUNEL法凋亡的心肌细胞,免疫组化方法检测心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达,病理图像分析系统进行凋亡心肌细胞、Bcl-2及Bax蛋白的表达分析。结果:与假手术组比较,给药组(Ⅳ、Ⅴ)心肌细胞的Bcl-2蛋白表达显著增多(P<0.05),Bax蛋白表达略增加(P>0.05)和显著降低(P<0.05),心肌细胞凋亡明显减少(P>0.05);心肌细胞组织结构损害明显减轻;对照组与假手术组比较线粒体有显著变化(P<0.01),给药组(Ⅳ、Ⅴ)与假手术组比较线粒体变化程度差异无统计学意义(P>0.05)。结论:参附注射液能明显抑制心肌缺血/再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡,其作用机制可能与上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达和保护线粒体相关。

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。

粉防己碱与硝苯地平对大鼠肺动脉高压影响对比的实验研究

目的:通过粉防己碱与硝苯地平对比实验研究,探讨粉防己碱与硝苯地平对肺动脉高压的治疗作用及其机制。方法:40只,雄性,Wistar大鼠,随机分为4组,即:模型组、粉防己碱治疗组、硝苯地平治疗组和对照组。采用左全肺切除复合腹腔注射野百合碱建立大鼠肺动脉高压模型,分别应用粉防己碱和硝苯地平按最低安全剂量进行灌胃干预、治疗组。测定大鼠血液中一氧化氮(NO)的含量,血流动力学指标,右心指数,光镜下观察肺小动脉病理变化。结果:两个治疗组肺动脉压力及右心指数均降低,均能够改善肺血管重构,但两者相比差异无统计学意义;血中NO含量粉防己碱组明显高于硝苯地平组,且对大鼠体循环压力影响小,两者相比较差异有统计学意义。结论:粉防已碱和硝苯地平均能够逆转野百合碱所致的大鼠肺动脉高压模型肺血管重建,降低肺动脉压力,但综合比较,前者对于降低肺动脉高压更有优势,可能与NO相关。

加减地黄饮子对阿尔茨海默病大鼠模型的实验研究

目的:探讨大鼠海马立体定向注射β-淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)后血清TNF-α和IL-1β含量的变化及加减地黄饮子对其影响。方法:100只SD大鼠随机分为空白对照组、假手术对照组、模型对照组、盐酸多奈哌齐对照组、加减地黄饮子组共5组,采用海马立体定向注射Aβ1-40诱导Alzheimer's病动物模型后,药物干预4周,第5周应用双抗夹心酶联免疫吸附测定法检测TNF-α和IL-1β含量。结果:模型组TNF-α和IL-1β含量显著高于假手术组(p<0.05)。与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和加减地黄饮子组TNF-α和IL-1β含量显著降低(p<0.05)。结论:大鼠海马注射Aβ1-40后大鼠血清TNF-α和IL-1β含量明显增高,加减地黄饮子通过降低血清TNF-α和IL-1β的含量,从而发挥其抗老年性痴呆的作用。

和胃接骨胶囊对实验性大鼠骨折愈合过程中BMP-2表达的影响

为探讨和胃接骨胶囊对实验性大鼠骨折愈合过程中骨形态发生蛋白-2表达的影响,取SD大鼠60只,随机分为生理盐水组、麝香接骨丹组、和胃接骨胶囊组,徒手造成大鼠下肢胫腓骨标准骨折模型,造模成功后分别于1、2、4、6周每组断颈法处死5只大鼠,取骨痂组织制成病理切片,采用免疫组化染色技术进行染色,并用图像分析系统对骨形态发生蛋白-2的表达进行定量分析。结果显示,在骨折愈合过程中各组骨形态发生蛋白-2含量的总体变化趋势基本相同,骨形态发生蛋白-2表达的高峰都出现在骨折后第2周,但和胃接骨胶囊组骨形态发生蛋白-2阳性产物含量优于同期其他两组(P<0.05)。表明和胃接骨胶囊能诱导骨形态发生蛋白-2的合成,可能是其促进骨折愈合的机理之一。

姜黄素对肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ.C含量及肝组织TGFβ_1的影响

目的:观察研究姜黄素对肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ.C含量及肝组织转化生长因子β1(TGFβ1)的影响效果及不同剂量与疗效的关系。方法:四氯化碳皮下注射加乙醇灌胃制备大鼠肝纤维化模型,随机分为病理模型组、姜黄素大、中、小剂量组、复方鳖甲软肝片组、γ-干扰素组,并设正常对照组。治疗结束后检测血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ.C含量;HE染色及胶原纤维、网状纤维染色观察肝组织纤维化程度;免疫组织化学方法(SABC法)检测分析肝组织TGFβ1的含量。结果:和病理模型组比较,姜黄素大、中剂量组血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ.C含量降低(P<0.05),SSS计分值明显降低P<0.05),肝组织中TGFβ1的含量明显下降(P<0.05)。结论:1.姜黄素具有治疗肝纤维化的作用,其机理可能与抑制肝组织中TGFβ1的表达有关。2.姜黄素抗肝纤维化存在有效的剂量范围,在一定剂量范围内,抗肝纤维化作用强度与剂量无明显依赖性。

气体信号分子硫化氢在油酸致大鼠急性肺损伤中的作用

目的:探讨胱硫脒-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)/硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)系统在急性肺损伤(acute lunginjury,ALI)中的作用。方法:尾静脉注射油酸(oleic acid,OA)制备大鼠ALI模型为OA组,对照组注射等量生理盐水,注射OA前给予硫氢化钠(NaHS)(14μmol/kg)作为NaHS+OA组,单纯给予NaHS(14μmol/kg)作为NaHS组,分别测定血浆及肺组织H2S生成量、CSE活性、3-巯基丙酮酸转硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MPST)活性、肺组织及血浆中丙二醛(MDA)、共轭二烯(Diene)键含量;并对肺部病变进行评定。结果:与对照组比较,OA组肺组织CSE、MPST活性及H2S浓度呈现下降趋势(P<0.01),血浆H2S浓度升高(P<0.01),血浆及肺组织MDA及Diene键含量升高(P<0.01);与OA组比较,NaHS+OA组血浆及肺组织MDA和Diene键含量明显下降(P<0.01)。结论:内源性CSE/H2S系统参与了OA致大鼠ALI的病理生理过程;给予外源性H2S可以减轻ALI时肺脏脂质过氧化损害。

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠的治疗作用。方法:健康雄性SD大鼠,随机分成3组,正常对照组、模型组和治疗组。通过烟熏法建立COPD模型后,大鼠尾静脉注射BMSCs进行生物治疗。应用细胞膜荧光染料PKH26标记的BMSCs回输大鼠体内,制作肺组织冰冻切片,在荧光显微镜下观察BMSCs是否定位于肺组织;采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测血清和肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)和活性丙二醛(MDA)含量;收集支气管肺泡灌洗液(BALF),计数细胞总数,并进行分类;制作肺组织病理切片,观察肺组织微细结构变化并定量测定肺平均内衬间隔(MLI)、平均肺泡数(MAN)。结果:BMSCs能够归巢到COPD大鼠的肺组织并存活;BM-SCs治疗组与模型组相比,血清中SOD的活性明显增高、MDA含量显著降低(P<0.05);BALF中细胞总数明显减少,中性粒细胞总数及比例均减小(P<0.05);病理有明显的改善,MLI减小,MAN增大(P<0.05)。结论:BMSCs对COPD大鼠具有治疗作用。

卡维地洛对大鼠急性心肌梗死后心肌重塑的影响

目的:建立大鼠急性心肌梗死(AMI)模型,用组织学的方法,观察AMI后早期卡维地洛处理,心肌重塑相关指标的变化。方法:结扎左冠状动脉前降支复制AMI模型。将大鼠随机分为假手术(S)组、心肌梗死组(I)、高剂量卡维地洛组(H)2mg·kg-1·d-1和低剂量卡维地洛组(L)1mg·kg-1·d-1。实验动物存活2h后,药物组每日口服不同剂量卡维地洛。各组均于用药后2周观察光镜及透视电镜下左心室心肌组织学改变并进行定量分析。结果:药物组心肌梗死面积明显减小(I组、L组和H组分别为0.149±0.010、0.039±0.009和0.028±0.004),与I组比较,P均<0.05,残存心肌纤维断裂及排列紊乱程度减轻;梗死区、非梗死区内心肌细胞退行性改变减轻,心肌细胞线粒体以增生、肿胀为主,线粒体膜完整,细胞核增大。心肌间质中幼稚毛细血管密度增加(I组、L组和H组分别为4.36±0.010,7.22±0.009和9.86±0.004),与I组比较,P均<0.05,上述改变在H组更明显。结论:AMI后卡维地洛早期干预,可改善AMI后心肌重塑水平并具有剂量依赖性。卡维地洛的线粒体保护作用可能是其抑制AMI后心肌重塑、改善AMI患者预后的细胞学机制之一。

多次移植人脐带间充质干细胞对大鼠Th1和Th2比值的影响

目的：观察多次静脉移植人脐带间充质干细胞（human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs）对大鼠Th1和Th2轴的影响.方法：①体外培养HUMSCs;流式细胞仪鉴定第4代hUMSCs表面抗原的表达；特异性诱导染色并鉴定第4代HUMSCs分化脂肪细胞和成骨细胞的潜能；②雄性SD大鼠30只,体质量182～203g,分为3组：空白对照组；0.9％氯化钠液组；干细胞移植组,每组10只.干细胞移植组：1次/w经尾静脉注射3.5×107/kg的HUMSCs,连续3次.第三次移植HUMSCs后11d,各组经腹主动脉取血,流式细胞仪检测T淋巴细胞的IFN-γ和IL-4阳性率.结果：3次注射干细胞后实验动物全部存活,干细胞组的Th1、Th2阳性率较0.9％氯化钠液组差异无统计学意义（P＞0.05）；Th1/Th2比值、血清IFN-γ和IL-4水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；干细胞组的心、脑、肺、肝及肾等脏器未发生病理改变.利用红色荧光蛋白转染的HUMSCs示踪,发现移植的HUMSCs大部分归巢于骨髓中.结论：多次尾静脉注射HUMSCs,未引起大鼠Th1、Th2细胞免疫和体液免疫系统的变化,Th1/Th2轴无明显改变.移植的HUMSCs能较长时间的存活于大鼠骨髓内,具有较好的免疫相容性.

合用卡托普利和氯沙坦对大鼠急性心肌梗死后梗死区胶原修复及早期左心室重构的影响

目的探讨大鼠急性心肌梗死(AMI)后早期联用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)对梗死区生长因子及胶原浓度的影响以及继而对左心室重构的影响。方法AMI大鼠随机分成对照组、卡托普利组和合用组,用药14d后测定梗死区及非梗死区血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、转化生长因子-β1(TGF-β1)及羟脯氨酸含量、心功能、左心室容积及重量。结果合用组梗死区AngⅡ、羟脯氨酸含量低于卡托普利组,TGF-β1也有减低趋势,而非梗死区AngⅡ、TGF-β1及羟脯氨酸含量2组间无差异。用药组对心脏功能的影响差异无显著性,合用组左心室舒张功能有低于卡托普利组的趋势;合用组左心室重量大于卡托普利组,但2组左心室容积差异无显著性。结论AMI后早期联用ACEI和ARB降低梗死区生长因子及胶原含量,不利于梗死区修复和左心室的较早期重构。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化与鉴定

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定。方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离、纯化培养大鼠BMSCs,测定生长曲线,流式细胞仪鉴定,免疫细胞化学检测。结果:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,P2、4、6代细胞生长曲线基本一致,增值能力强,呈均一成纤维样细胞,P3代以后细胞均一地表达细胞表面抗原CD44、CD90,不表达CD34,弱表达CD11b/c,细胞表达Connexin43。结论:本实验建立了一种体外稳定培养扩增大鼠BMSCs的方法,培养的细胞成分单一,适用于对BMSCs进一步的应用研究。

大鼠静脉注射人脐带胶样组织来源间充质干细胞的安全性研究

目的：观察大鼠静脉输注人脐带胶样组织间充质干细胞（HUMSCs）的异常毒性.方法：①贴块法培养男婴脐带间充质干细胞；流式细胞仪鉴定第4代HUMSCs表面抗原的表达；标准试剂盒鉴定第4代HUMSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能；②SD大鼠,180 ～ 190g,16只,分为对照组和实验组,各8只,雌雄各50％.实验组尾静脉注射第4代HUMSCs×107/mL,0.5mL;注射后第5天,腹主动脉取血,监测和比较血常规和生化指标,取脑、心、肺、肝及肾进行病理学检测比较.结果：①第4代HUM-SCs特异性表面抗原CD73、CD90和CD105表达强阳性,其纯度分别达到95.1％、98.8％和98.3％；而表面抗原CD34、CD45、CDllb、CD19、CD14、CD79a和HLA-DR的表达水平分别为0.6％、1.2％、5.6％、0.3％、9.3％、0.2％和零；HUMSCs分化成脂细胞和成骨细胞的比例分别为97.6％和95.8％；②注射干细胞后实验动物全部存活,第5天时,实验组24项血常规指标与对照组比较差异无统计学意义；③实验组血糖、AGA、糖化血红白蛋白、心肌酶、CO2较对照组明显降低,其他指标无显著性变化；④实验组脑、心、肺、肝及肾的大小和形态,病理学检查与对照组相比无明显改变.结论：一次大剂量尾静脉注射HUMSCs,没有引起大鼠异常毒性反应.

BMP-2诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的细胞形态学及生物学特性观察

目的探讨骨形态发生蛋白2(BMP-2)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导成脂分化后BMSCs细胞形态学的影响,确定BMP-2抑制BMSCs成脂分化的优选浓度。方法抽取大鼠的骨髓,体外用贴壁培养法获得原代BMSCs,流式细胞仪检测P2细胞表面抗原标志物;实验取第二、三代细胞,设计5个实验组及1个对照组:实验组第一阶段用成脂诱导液诱导3d,第二阶段在成脂诱导液中分别添加BMP-2 0.5、5.0、50.0、100.0、200.0ng·mL^(-1)继续诱导14d;而对照组始终用BMSCs培养基培养。各组经诱导后第17天用油红O染色,观察细胞脂滴染色情况及检测细胞成脂OD值,显微镜下观察细胞形态的变化。结果流式细胞术结果显示P2细胞表达CD44、HLA-ABC、CD105分别为95.5%、96.8%和92.0%,而阴性抗原CD34、CD45表达分别为0.683%和0.377%。油红O染色图片显示:BMP-2在0.5~50.0ng·mL^(-1)的质量浓度下脂滴数呈现增多趋势,而在100.0~200.0ng·mL^(-1)的质量浓度下脂滴数呈下降趋势。实验组BMP-2 50.0ng·mL^(-1)的脂肪定量OD值>BMP-2 0.5ng·mL^(-1)的脂肪定量OD值,而BMP-2 200.0ng·mL^(-1)的脂肪定量OD值<BMP-2 100ng·mL^(-1)的脂肪定量OD值(均P<0.05)。实验组BMP-2质量浓度在50.0~100.0ng·mL^(-1),脂肪定量OD值分析变化不大(P>0.05)。结论通过贴壁培养可获得高纯度BMSCs。BMP-2质量浓度低于100ng·mL^(-1)时,具有诱导BMSCs成脂分化的能力;BMP-2质量浓度超过100ng·mL^(-1),则可以抑制BMSCs成脂分化,从而减少大鼠脂肪细胞的形成。

大鼠肝脏组织视黄醇结合蛋白4在衰老过程中表达及与胰岛素抵抗的关系

目的:观察大鼠肝脏组织视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4,RBP4)在衰老过程中表达差异,在分子水平上探讨衰老过程中出现胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)的可能机制。方法:用Bergman创立的微小模型技术评价年轻鼠(8～12周龄)和老年鼠(24个月龄)的胰岛素敏感性,取大鼠肝脏组织提取总RNA,采用半定量RT-PCR法检测RBP4和过氧化体增殖物激活型受体α(peroxisomeproliferator-activated receptorα,PPARα)mRNA水平,用Western blot法检测RBP4和PPARα蛋白表达情况。结果:与年轻鼠组比较,老年鼠组存在明显的胰岛素抵抗,而老年鼠组的RBP4mRNA及蛋白表达明显升高,PPARαmRNA及蛋白表达明显减少。结论:衰老过程中大鼠肝脏组织RBP4表达升高可能与胰岛素抵抗有关。

长效硝酸酯对心力衰竭大鼠心脏血管紧张素Ⅱ受体表达水平的影响

目的:探讨长效硝酸酯(异乐定)对心肌梗死后慢性心力衰竭(CHF)大鼠心功能、血浆肾素活性(plasma renin activity,PRA)和血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)水平以及非梗死区左心室组织血管紧张素II受体(Angiotensin II receptor,ATR)各亚型表达水平的影响。方法:选用雄性Wistar大鼠,随机分为正常对照组(N组)、假手术组(SH组),结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死后心力衰竭模型,分为心力衰竭模型组(HF组)、硝酸酯小剂量组(LN组)、硝酸酯大剂量组(HN组)、阳性药物对照组(奥美沙坦酯,OL组)及硝酸酯大剂量联合阳性药物组(HN+OL组),灌胃法给药6周。超声心动图检测用药前后心功能,放射免疫法检测血浆PRA、Ang II水平,RT-PCR和Western blot检测各组心肌AT1R及AT2R的表达水平。结果:1用药后,与HF组相比,HN组、OL组和HN+OL组左心室射血分数(LVEF)显著升高(P<0.05);与OL组相比,HN+OL组LVEF显著升高(P<0.05)。2与SH组相比,HF组PRA、Ang II水平显著升高(P<0.01),AT2R表达水平明显上调(P<0.05),AT1R表达水平明显下调(P<0.05);与HF组相比,HN、OL和HN+OL组PRA、Ang II水平均显著下降(P<0.05、P<0.01),AT2R表达明显下调(P<0.05),AT1R表达明显上调(P<0.05);与OL组相比,HN+OL组AT1R显著上调,AT2R显著下调(P<0.05)。结论:应用长效硝酸酯能降低CHF循环中PRA、Ang II水平,同时使CHF心脏AT1R、AT2R的表达水平反向调节趋于正常,并提高LVEF,显著改善了心功能。大剂量硝酸酯的疗效明显优于小剂量,并可协同奥美沙坦改善心功能。