基于HMGB1介导的肺动脉平滑肌细胞焦亡探讨复方葶苈子汤治疗COPD-PH的作用机制

目的研究高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)介导的肺动脉平滑肌细胞焦亡对慢性阻塞性肺疾病相关性肺动脉高压(chronic obstructive pulmonary disease-associated pulmonary hypertension,COPD-PH)形成的影响,及复方葶苈子汤的干预机制。方法以CCK-8法检测大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的活性,筛选出合适的香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)干预浓度及时间用于建立细胞损伤模型。将对数生长期细胞分为对照组、CSE组、LPS组和CSE+LPS组,对照组加入细胞培养液培养细胞。CSE组加入含10%CSE的细胞培养液,LPS组加入含1μg/mL LPS的细胞培养液,CSE+LPS组加入含10%CSE和1μg/mL LPS的细胞培养液,培养细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活性,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测细胞中mRNA表达,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测细胞中蛋白表达,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中炎症因子含量,流式细胞术检测细胞焦亡,透射电子显微镜观察细胞的超微结构。以CCK-8法检测PASMCs的活性,筛选出复方葶苈子汤含药血清和甘草酸的最佳干预浓度及时间。将对数生长期细胞分为正常组、模型组、含药血清组和抑制剂组,对照组加入细胞培养液培养细胞,模型组、含药血清组和抑制剂组加入含10%CSE和1μg/mL LPS的细胞培养液,培养细胞24 h后弃去原培养液。正常组和模型组孔中加入含10%空白血清的细胞培养液,含药血清组孔中加入含10%复方葶苈子汤含药血清的细胞培养液,抑制剂组孔中加入含150μg/mL甘草酸和10%空白血清的细胞培养液,再培养细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活性,RT-PCR检测细胞中mRNA表达,WB检测细胞中蛋白表达,ELISA检测细胞上清液中炎症因子含量,流式细胞术检测细胞焦亡,透射电子显微镜观察细胞的超微结构。结果筛选出10%CSE和1μg/mL LPS用于建立细胞损伤模型,干预时间为24 h。CSE、LPS和CSE联合LPS可以使PASMCs活性下降;可以促进PASMCs中HMGB1、RAGE、Caspase-8和GSDMD mRNA表达,HMGB1、RAGE、pro Caspase-8、cleaved Caspase-8和GSDMD蛋白表达,促进PASMCs上清液中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)分泌,促进PASMCs焦亡发生。筛选出10%复方葶苈子汤含药血清和150μg/mL甘草酸用于细胞干预,干预时间为24 h。复方葶苈子汤含药血清可以使损伤PASMCs活性升高;可以抑制损伤PASMCs中HMGB1、RAGE、Caspase-8和GSDMD mRNA表达,HMGB1、RAGE、pro Caspase-8、cleaved Caspase-8和GSDMD蛋白表达,抑制损伤PASMCs上清液中IL-1β和IL-18分泌,抑制PASMCs焦亡发生。结论复方葶苈子汤可以通过抑制HMGB1表达,抑制Caspase-8介导的PASMCs焦亡,并抑制炎症级联反应,从而改善COPD-PH。

虎杖苷调节YAP1/TAZ信号通路对缺氧性肺动脉高压新生大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探究虎杖苷(PD)对缺氧性肺动脉高压(HPH)新生大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法 将新生大鼠随机分为6组:对照组、模型组、PD低剂量组、PD中剂量组、PD高剂量组、PD高剂量+Hippo通路抑制剂(PD高剂量+XMU-MP-1)组,每组10只。缺氧2周后,检测各组大鼠右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI),苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化,并计算肺动脉管壁厚度占总厚度的百分比(WT%)和管壁面积占总面积的百分比(WA%)。分离各组新生大鼠PASMCs,分为NC组、低氧(Hypoxia)组、PD低剂量组、PD中剂量组、PD高剂量组、PD高剂量+XMU-MP-1组。CCK-8和EdU检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹(Western blot)检测肺组织和PASMCs中Yes相关蛋白1(YAP1)、PDZ结合域的转录共刺激因子信号通路(TAZ)、哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)蛋白表达。结果 与对照组相比,模型组大鼠肺动脉管壁明显增厚,管腔变窄,RVSP、RVHI、WT%、WA%、YAP1、MST1、TAZ蛋白表达显著升高(均P<0.05);与模型组相比,PD低、中、高剂量组大鼠肺动脉增厚减少,管腔变大,RVSP、RVHI、WT%、WA%、YAP1、MST1、TAZ蛋白表达显著降低,且PD各组间差异存在剂量依赖性(均P<0.05);XMU-MP-1可逆转这一结果。与NC组相比,Hypoxia组细胞A_(450nm)值、EdU阳性率、YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表达显著升高,凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(均P<0.05);与Hypoxia组相比,PD低、中、高剂量组细胞A_(450nm)值、EdU阳性率、YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表达显著降低,凋亡率、Bax表达显著升高,且PD各组间有剂量依赖性(均P<0.05);XMU-MP-1可逆转这一结果。结论 PD可能通过抑制YAP1/TAZ信号通路抑制HPH新生大鼠PASMCs增殖,促进凋亡。

Nrf2调控的氧化应激在Adropin抑制低氧肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用研究

目的 观察Adropin对低氧诱导的SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及氧化应激的影响,并探讨其可能机制。方法 以1%的O_(2)作为诱导剂,建立PASMCs增殖及氧化应激的细胞模型,通过活性氧(ROS)激活剂H_(2)O_(2),抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及不同浓度Adropin(100、300、1000 nmol·L^(-1))干预24 h后,检测细胞增殖及ROS,筛选Adropin抑制增殖及氧化应激的最适浓度。选择1000 nmol·L^(-1) Adropin和/或核因子E2相关因子2(Nfr2)抑制剂ML385在低氧条件下孵育PASMCs 24 h,并设置Nrf2激活剂富马酸二甲酯(DMF)作为阳性对照组,通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖;DCFH-DA探针联合荧光酶标仪测定细胞内ROS的水平;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)的水平;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测Nrf2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E的表达。结果 与对照组相比较,H_(2)O_(2)及低氧均能够诱导PASMCs增殖及ROS生成,而不同浓度的Adropin(100、300、1000nmol·L^(-1))和NAC均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖及ROS产生,且Adropin抑制增殖及ROS产生具有浓度依赖性。与低氧组相比较,DMF或Adropin(1000 nmol·L^(-1))干预后,PASMCs增殖及细胞内ROS水平下降,SOD、GPx、CAT活性增加,MDA水平下降,Nrf2表达上调(P<0.05),而ML385能够逆转Adropin的上述作用(P<0.05);DMF或Adropin能够通过抑制Cyclin D1与Cyclin E的表达,阻滞细胞周期于G_(0)/G_(1)期,从而抑制PASMCs增殖(P<0.05),而ML385能够逆转Adropin上述作用(P<0.05)。结论 Adropin可通过抑制氧化应激抑制低氧诱导的PASMCs增殖,其机制可能与激活Nrf2有关。

PI3K/Akt/FoxO1信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响

目的探究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞(hPASMC)及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响。方法细胞实验部分,将hPASMC分为4组:(1)空白对照组;(2)血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)组;(3)PDGF-BB+LY294002组;(4)PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)组。采用TUNEL检测细胞凋亡,采用蛋白质印迹法检测Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。动物实验部分,将12只SD大鼠随机分为4组:(1)空白对照组;(2)野百合碱(MCT)组;(3)MCT+LY294002组;(4)MCT+paclitaxel组。采用Western blot检测Bcl-2、cleaved caspase-3和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。结果细胞实验部分:相比于PDGF-BB组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的Bcl-2表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3表达水平上升(P<0.01);相比于空白对照组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的凋亡率增加(P<0.01)。动物实验部分:相比于MCT组,MCT+LY294002组与MCT+paclitaxel组Bcl-2、磷酸化Akt与磷酸化FoxO1表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3与FoxO1表达水平上升(P<0.01)。各组之间PI3K表达水平无显著差异。结论PI3K/Akt/FoxO1信号通路抑制hPASMC与肺动脉高压大鼠肺组织的细胞凋亡。

吲哚-3-甲醇通过抑制mTOR/HIF-1α信号通路减弱低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的观察吲哚-3-甲醇(I3C)对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的作用。方法采用0.2%Ⅰ型胶原酶消化分离SD大鼠PASMCs,以低氧(1%O2)作为诱导剂,建立PASMCs增殖的细胞模型,以不同浓度的I3C(25、50、100、200μmol·L^(-1))干预24 h,检测细胞增殖及存活率;设置哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂rapamycin或缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)抑制剂LW6为阳性对照组,以100μmol·L^(-1 )I3C,HIF-1α稳定剂DMOG或mTOR激活剂MHY1485干预24 h后,CCK-8试剂盒检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测HIF-1α、总的mTOR及磷酸化的mTOR和细胞周期调控相关蛋白的表达,确定I3C抑制PASMCs增殖的作用机制。结果25~100μmol·L^(-1 )I3C抑制低氧诱导的PASMCs增殖的作用具有浓度依赖性(P<0.05),而100μmol·L^(-1)与200μmol·L^(-1 )I3C抑制细胞增殖的作用无明显差异,且I3C无明显细胞毒性作用。I3C(100μmol·L^(-1))与LW6均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制HIF-1α、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2、CDK4和CDK6的表达(P<0.05),且DMOG能够逆转I3C的上述作用(P<0.05)。另外I3C与rapamycin在抑制低氧诱导的PASMCs增殖与mTOR/HIF-1α信号通路活化方面作用相似,且MHY1485能够逆转I3C抑制细胞增殖及mTOR/HIF-1α信号通路活化的作用(P<0.05)。结论I3C可通过抑制mTOR/HIF-1α信号通路减弱低氧诱导的PASMCs增殖。

消皮素B在人主动脉夹层组织中的表达变化及对主动脉平滑肌细胞焦亡、炎症反应的影响

目的观察人主动脉夹层组织消皮素B(GSDMB)表达变化,并探讨GSDMB对人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)焦亡和炎症反应的影响。方法收集主动脉夹层患者的主动脉夹层组织、器官捐献者的主动脉组织(正常对照组织)各8例份,采用Western blotting法检测GSDMB蛋白表达。将对数生长期的HASMCs分为NC-siRNA组(转染NC-siRNA)、脂多糖(LPS)组(LPS作用)、GSDMB-siRNA组(转染GSDMB-siRNA)、GSDMB-siRNA+LPS组(LPS作用后转染GSDMB-siRNA),另将HASMCs分为空载质粒组(转染空载质粒)、LPS作用组(LPS作用)、GSDMB过表达组(转染GSDMB过表达质粒)、GSDMB过表达+LPS组(LPS作用后转染GSDMB过表达质粒),采用Western blotting法检测细胞GSDMB、半胱氨酸蛋白酶4(Caspase-4)、消皮素D(GSDMD)、N-消皮素D(N-GSDMD)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达,流式细胞术检测细胞焦亡率,ELISA法检测细胞上清液白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素1β(IL-1β)水平。结果主动脉夹层组织与正常对照组织GSDMB蛋白相对表达量分别为0.88±0.16、0.62±0.15,二者比较P<0.05。与NC-siRNA组比较,LPS组GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白相对表达量和细胞焦亡率及细胞上清液IL-18、IL-1β水平均升高,GSDMB-siRNA组仅GSDMB蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。与LPS组比较,GSDMB-siRNA+LPS组GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白相对表达量和细胞焦亡率及细胞上清液IL-18、IL-1β水平均降低(P均<0.05)。与空载质粒组比较,LPS作用组GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白相对表达量和细胞焦亡率及细胞上清液IL-18、IL-1β水平均升高(P均<0.05),GSDMB过表达组仅GSDMB蛋白相对表达量升高(P<0.05)。与LPS作用组比较,GSDMB过表达+LPS组GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白相对表达量和细胞焦亡率及细胞上清液IL-18、IL-1β水平均升高(P均<0.05)。结论人主动脉夹层组织GSDMB表达升高;GSDMB不会影响正常HASMCs的焦亡和炎症反应,但会通过Caspase-4介导的非经典途径正向调控LPS诱导的HASMCs焦亡和炎症反应。

U-50488H抑制低氧诱导的原代肺动脉平滑肌细胞线粒体自噬

目的探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞线粒体自噬的影响及κ-阿片受体激动剂U-50488H在其中的作用。方法培养原代肺动脉平滑肌细胞,随机分组后进行低氧联合给药处理,检测线粒体自噬蛋白Bnip3及Pink1及其mRNA水平变化。结果低氧处理1 d后,肺动脉平滑肌细胞Bnip3及Pink1蛋白水平显著上升(P<0.05),U-50488H处理可以抑制Pink1的表达(P<0.01);低氧联合自噬激动剂ABT-737处理后肺动脉平滑肌细胞线粒体自噬通路显著激活(P<0.01),但可被U-50488H显著抑制(P<0.01)。结论低氧处理1 d后肺动脉平滑肌细胞线粒体自噬水平显著升高,应用U-50488H后可以显著抑制低氧刺激导致的肺动脉平滑肌细胞线粒体自噬相关蛋白转录与翻译。

POSTN通过ERK1/2信号通路诱导肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探索骨膜蛋白(periostin,POSTN)诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)增殖在缺氧诱导肺动脉高压(hypoxia-induced pulmonary hypertension,HPH)发病中的作用及其机制。方法取自雄性大鼠的原代PASMC暴露于缺氧环境模拟HPH,将细胞分为常氧组、缺氧组、缺氧+对照腺病毒转染组(Ad-shNC组)、缺氧+POSTN沉默腺病毒转染组(Ad-shPOSTN组)、POSTN组、POSTN+U0126组。采用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)评估PASMC的纯度,CCK-8法检测细胞活力,Western blot法检测PASMC中POSTN、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、骨形态发生蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein typeⅡreceptor,BMPR2)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)及细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的蛋白表达水平。结果与常氧组比较,缺氧促进PASMC增殖和POSTN蛋白表达,抑制BMPR2蛋白表达。下调POSTN表达可抑制缺氧诱导的PASMC增殖,恢复BMPR2蛋白表达水平。此外,POSTN明显增加p-ERK1/2或ERK1/2的蛋白表达水平,增加PASMC增殖,而这些效应可被U0126阻断。结论在HPH病理机制中,POSTN促进PASMC增殖,其潜在的机制可能与调节BMPR2表达和活化ERK1/2信号通路有关。

NO缓释纳米粒子PEG-b-PAASNO对肺动脉平滑肌细胞的影响

目的:探讨一氧化氮(NO)供体聚合物胶束PEG-b-PAASNO(PSNO)对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的影响。方法:构建PSNO并检测体外释放NO水平。分离并培养大鼠PASMC,CCK8确定PSNO安全浓度范围和有效作用浓度。设立空白对照组、PSNO(250 ng·mL^(-1))组(PSNO组)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB,15 ng·mL^(-1))组(BB组)和PDGF-BB+PSNO(15 ng·mL^(-1)PDGF-BB+250 ng·mL^(-1)PSNO)组(BB+PSNO组),用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EDU)实验、划痕实验和Transwell实验评估PSNO对PASMC增殖、迁移能力的影响,免疫印迹法评估PASMC增殖、收缩、细胞周期相关蛋白[增殖细胞核抗原(PCNA)、钙调蛋白(calponin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)]的表达水平。组间比较采用one-way ANOVA分析。结果:成功构建稳定释放NO的纳米聚合物胶束PSNO,连续释放NO超过48 h,效应呈时间-剂量依赖性。PSNO质量浓度为250 ng·mL^(-1)时有效抑制PDGF-BB诱导的PASMC增殖、迁移;与BB组相比,BB+PSNO组PCNA、calponin、α-SMA、cyclin D1和CDK2蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建一种可以稳定释放NO的纳米聚合物胶束PSNO,其有效释放NO超48 h,功能上阻滞PASMC增殖、迁移,并降低PASMC收缩、细胞周期相关蛋白表达水平。

miRNA-182通过FGF9调节肺动脉平滑肌细胞表型的研究

目的研究miRNA-182及其靶蛋白成纤维生长因子9(FGF9)对肺动脉平滑肌细胞表型转换的调节作用。方法体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC),用miRNA-182模拟体转染的方法使其过表达,FGF9siRNA转染使其沉默;使用CCK8方法检测细胞增殖能力,分别用RT-q PCR检测miRNA-182的表达,PCR方法检测FGF9及收缩型表型标记物(SMA,SM22α及myosin)的基因水平,Western blot检测其蛋白水平。结果过表达miRNA-182,收缩表型标记物SMA,SM22α及myosin基因表达水平明显升高,SMA蛋白表达量明显增加,转染miRNA-182抑制物之后,SMA蛋白表达量降低;另外,细胞相对吸光度降低,增殖被抑制,并且转染模拟体80 nmol/L较转染40 nmol/L吸光度更低;而转染miRNA-182抑制物之后,细胞相对吸光度明显增强,细胞增殖增加。过表达miR-182后,FGF9mRNA的表达明显降低,并且与模拟体的转染浓度直接相关。沉默FGF9表达之后SMA、SM22α和myosin表达增加,并抑制PASMC的增殖能力,同时沉默miR-182和FGF9表达之后,SMA、SM22α和myosin表达增高。结论miRNA-182通过靶向抑制FGF9蛋白的表达,抑制PASMC收缩型向合成型转化,同时抑制其增殖能力。

15-HETE对肺动脉平滑肌细胞钙离子浓度的影响

目的 通过阻断细胞外钙离子 (Ca2+ )内流,观察 15 羟化二十烷四烯酸 ( 15 HETE)对兔肺动脉环收缩张力和肺动脉平滑肌细胞内游离钙浓度 ( [Ca2+ ]i)的影响,探讨缺氧时 15 HETE引起细胞钙动员的机制。方法 采用组织浴槽血管环方法观察L 型钙通道阻断剂硝苯地平和无钙液对15 HETE诱导的兔肺动脉环收缩力的影响;酶法分离培养兔肺动脉平滑肌细胞,激光扫描共聚焦显微镜测定 15 HETE对细胞内 [Ca2+ ]i的作用。结果 在正常组和缺氧组, 10μmol·L-1硝苯地平和无钙液对 1μmol·L-1 15 HETE引起的肺动脉环收缩均没有影响;培养的 15 HETE组细胞 (正常培养的细胞暴露于 1 μmol·L-1 15 HETE下继续孵育 8min)与正常对照组相比,细胞内 [Ca2+ ]i明显增加 (P<0 05)。结论 15 HETE可引起肺动脉平滑肌细胞 [Ca2+ ]i增加,且此钙来源于细胞内贮钙库的释放。

阿魏酸钠拮抗氧化型脂蛋白(a)对人动脉平滑肌细胞的作用

目的 :研究脂蛋白 (a) [Lp(a) ]氧化前后致人动脉平滑肌细胞 (SMC)增殖及细胞内游离钙浓度([Ca2 + ] i)的变化 ,观察阿魏酸钠 (SF)对其的影响。方法 :Lp(a)经体外Cu2 + 氧化法氧化 ,硫代巴比妥酸 (TBARS)比色法检测氧化程度 ,培养的人动脉SMC中分别加入不同浓度SF ,作用 1 2h后再与天然和氧化型Lp(a)共同孵育 ,以MTT比色法、流式细胞仪检测细胞增殖状况 ,采用荧光探针Fura - 2 /AM检测细胞 [Ca2 + ] i。结果 :氧化型Lp(a)促人动脉SMC增殖的同时亦明显增加了 [Ca2 + ] i 水平 ,作用较天然Lp(a)明显 ,SF(40 ,80mg/L)可显著抑制氧化型Lp(a)所致的细胞增殖和 [Ca2 + ] i增加 ,并呈剂量效应关系 ,而对天然Lp(a)所致的细胞增殖和 [Ca2 + ] i 增加无明显影响。结论 :氧化型Lp(a)通过升高 [Ca2 + ] i 而显著促动脉SMC增殖可能是其致动脉粥样硬化的机制之一 。

大鼠细小肺动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定方法的研究

目的:建立一种重复性好、培养周期短及传代次数多的大鼠细小肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)培养方法。方法:在无菌条件下,分离雄性SD大鼠肺细小动脉,剥离外膜和剔除内皮细胞,经胶原酶I消化,培养PASMCs。0.4%台盼蓝染色测定细胞活力;倒置相差显微镜观察;免疫细胞化学法和免疫荧光染色法,进行平滑肌α-肌动蛋白(α-SMactin)鉴定。结果:形态学观察、免疫细胞化学法及免疫荧光染色法鉴定表明培养细胞为PASMCs;细胞存活率在96.5%以上;原代培养后4～7d即可传代,并且生长特点、细胞形态不易发生改变。结论:采用胶原酶I消化法培养PASMCs,方法简单、酶消化时间易控制、培养周期短、重复性好,培养的原代PASMCs具有数量多和生长迅速的特点。

参与肺动脉平滑肌细胞增殖信号转导机制及信号转导抑制剂的研究进展

肺动脉高压是一种以肺血管阻力升高为特征,最终导致右心功能严重受限、衰竭甚至死亡的慢性进展性疾病。其组织病理学改变主要以肺血管重构为特点,而肺动脉平滑肌细胞在外周血管的异常增殖是肺血管重构的主要病理基础。该文主要对参与肺动脉平滑肌细胞增殖信号转导机制及信号转导抑制剂的研究进展作一综述。

川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用

本工作旨在研究川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞钾通道的作用,为阐明其扩张冠状动脉血管的机制提供实验依据。采用膜片钳细胞贴附式和内面向外式记录方式观察川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+- activated potassium channels,BKCa channels)的作用,分别用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89和蛋白激酶G (protein kinase G,PKG)抑制剂KT-5823处理细胞,再观察川芎嗪对BKCa通道作用的变化。结果表明在研究的0．73-8．07 mmol/L浓度范围,川芎嗪可以剂量依赖性地激活BKCa通道,使通道的开放概率从(0．01±0．003)增加到(0．03±0．01)-(．21± 0．18)(P<0．01,n=10),使通道平均关闭时间从(732．33±90．67)ms降低到(359．67±41．30)-(2．96±0．52)ms(P<0．01, n=10)。川芎嗪的这种激活作用在浴液游离钙离子浓度接近0 mmol/L时也存在。PKA的特异性抑制剂H-89(3 μmol/L)和 PKG的特异性抑制剂KT-5823(1 μmol/L)对川芎嗪激活BKCa通道的作用无影响。以上结果提示:川芎嗪能直接激活冠状动脉平滑肌BKCa通道,这种作用可能是川芎嗪扩张冠状动脉血管的一种重要机制。

三七皂苷R1对肺高压大鼠肺动脉平滑肌细胞SOCE的抑制作用

目的探讨三七皂苷R1(notoginsenoside R1)对慢性低氧(chronic hypoxia,CH)及野百合碱(monocrotaline,MCT)致肺高压(pulmonary hypertension,PH)大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)钙池操纵性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE)的作用。方法制备CH及MCT致PH大鼠模型,通过Mn2+淬灭Fura-2荧光和Fluo-3荧光检测胞质游离Ca2+浓度(intracellular free calcium concentration,[Ca2+]i)观察三七皂苷R1对CH及MCT致PH大鼠PASMCs SOCE的作用。结果成功制备CH及MCT致PH大鼠模型;在硝苯地平预处理情况下,10μmol·L-1三七皂苷R1可明显降低环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)诱导CH及MCT致PH大鼠PASMCs Mn2+淬灭幅度、Mn2+最大淬灭率、胞膜Ca2+内流量和静息[Ca2+]i。结论三七皂苷R1对CH及MCT致PH大鼠PASMCs具有抑制SOCE和降低静息[Ca2+]i的作用。

银杏内酯B对牛主动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的 探讨银杏内酯B(GB)对牛主动脉平滑肌细胞 (SMC)增殖的影响及可能机制。方法 细胞的增殖由3H 胸腺嘧啶核苷掺入试验确定 ,应用流式细胞术测定细胞周期 ,用MTT法和乳酸脱氢酶活性检测观察细胞代谢的变化。结果 无论是否用血管紧张素II诱导 ,GB与银杏内酯A和B的混合物均呈浓度依赖性地抑制SMC的增殖 ,其机制与阻止细胞进入有丝分裂期有关。结论 GB可抑制动脉壁SMC的增殖 。

磁场抑制动脉平滑肌细胞增殖作用的研究

目的 :探讨不同场强、不同作用时间的低频电磁场对兔主动脉平滑肌细胞增殖的调控作用。 方法 :体外培养的新西兰白兔主动脉平滑肌细胞 3～ 7代与含 5 %小牛血清的 RPMI- 16 40培养液的混悬液 10 0 μl加入 96孔板中培养 ,按照实验分组 ,每日磁场作用 1次 ,共 2日。 72 h后用四唑盐比色法和氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H- Td R)掺入法检测动脉平滑肌细胞的增殖数量。 结果 :2 0 m T、40 m T和 6 0 m T各磁场组动脉平滑肌细胞的增殖数量显著低于对照组 (P<0 .0 5 ) ,其中 30 min、40m T磁场组动脉平滑肌细胞增殖数量的降低最显著 (P<0 .0 0 1)。 结论 :磁场对动脉平滑肌细胞增殖有显著的抑制作用 ,这种抑制效应具有强度敏感性和时间依赖性。

硫化氢对正常及自发性高血压大鼠主动脉平滑肌细胞PCNA和P-ERK蛋白表达的影响

目的研究硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）对正常大鼠及自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rat，SHR）主动脉平滑肌细胞（aoric smooth muscle cell，ASMC）增殖的影响。方法分别将正常大鼠及SHR主动脉平滑肌细胞分为实验组和对照组，实验组中分别加入浓度为（10^-5～10^-3）mol·L^-1 H2S供体的硫氢化钠（sodium hydrosuifide，NaHS）或浓度为（2～10）mmol·L^-1胱硫醚-γ-裂解酶抑制剂的炔丙基甘氨酸（DL-propargylglycine，PPG），对照组加入等体积的生理盐水，分别以蛋白质印迹法观察6、12、18和24h时间点的平滑肌细胞中细胞增殖核抗原（PCNA）和磷酸化的细胞外信号调节激酶（p-ERK）蛋白表达情况。结果NaHS对正常大鼠ASMC增殖及p-ERK蛋白表达无影响。PPG显著促进正常大鼠ASMC增殖及p-ERK蛋白表达。NaHS显著抑制SHR的ASMC增殖及p-ERK蛋白表达。PPG显著促进SHR的ASMC增殖及p-ERK蛋白表达。结论内源性H2S下调可促进正常大鼠及SHR的ASMC增殖，而外源性补充H2S可抑制SHR的ASMC异常增殖，ERK信号途径可能介导H2S抑制ASMC增殖的分子机制。

缺氧肺动脉平滑肌细胞中线粒体ATP敏感钾通道开放对细胞色素C的分布及细胞增殖的作用

为了探讨线粒体ATP敏感钾通道(mitochondrial ATP-sensitive K^+channel,mitoK_(ATP))和线粒体膜电位(ΔΨm)在细胞缺氧信号转导中的作用以及对缺氧肺动脉平滑肌细胞中细胞色素C在细胞内的分布及细胞增殖的影响,本实验将人肺动脉平滑肌细胞进行常氧或24h缺氧培养,并将标本分为六组：(1)对照组；(2)mitoK_(ATP)开放剂diazoxide组；(3)mitoK_(ATP)阻断剂5-HD组：(4)24h缺氧组：(5)24h缺氧+diazoxide组；(6)24h缺氧+5．HD组。利用激光共聚焦显微镜成像法检测ΔΨm：线粒体/胞浆成分分离试剂盒(BioVision)分离线粒体和胞浆成分后,Western blot检测两者细胞色素C：Western blot检测细胞中caspase-9的蛋白表达量；MTT法及PI染色后流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果显示：(1)diazoxide作用24h后,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少,与正常对照组相比较,均P＜0．05；而5-HD作用24h与正常对照组比较,上述指标无明显变化(P＞0．05)。(2)缺氧24h组,结果与diazoxide组相似,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少,与正常对照组相比较,均P＜0．05：24h缺氧+diazoxide组与缺氧组相比较,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少(P＜0．05)；而24h缺氧+5-HD组与缺氧组比较,R-123荧光明显降低,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显升高,caspase-9的蛋白表达显著增加,细胞增殖明显减少、凋亡增多(P＜0．05)。上述实验结果提示,缺氧可以引起mitoK_(ATP)的开放以及ΔΨm的去极化,并进而抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆,抑制线粒体凋亡途径,从而参与并影响肺动脉高压的发生、发展。