猪圆环病毒2型体外刺激猪髋动脉血管内皮细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

通过PCV2病毒感染猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)后炎症相关细胞因子mRNA转录水平变化,探讨PCV2感染诱导炎症产生的免疫机制。将PCV2病毒体外接种PIEC,感染不同时间后,收集样品,荧光定量PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-8及IL-18 mRNA转录水平的变化。结果显示,PCV2感染PIEC后,对促炎症细胞因子IL-1β、IL-18及趋化因子IL-8主要起上调表达作用。由此推测细胞因子在体内的综合效应会导致PCV2感染早期机体产生过度炎症反应,并趋化中性粒细胞,引发机体免疫抑制,影响机体特异性免疫应答的正常运转,为PCVD的发病创造条件。

载脂蛋白CⅢ刺激猪主动脉血管内皮细胞差异表达基因的研究

本研究旨在探究载脂蛋白CⅢ(ApoCⅢ)刺激猪主动脉血管内皮细胞前后的差异基因表达谱,从而揭示ApoCⅢ的功能。利用酶解法成功分离猪主动脉血管内皮细胞并进行体外培养,采用高通量测序技术筛选出ApoCⅢ刺激前后的差异表达基因。结果表明,ApoCⅢ刺激猪主动脉血管内皮细胞前后共有647个差异表达基因,包括390个上调表达基因和257个下调表达基因。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明,高通量测序数据结果正确可靠。GO及Pathway分析结果显示,差异表达基因的功能涉及免疫应答、细胞凋亡及死亡等。这表明ApoCⅢ可通过炎症反应、细胞黏附、细胞凋亡等分子通路影响猪主动脉血管内皮细胞的生理功能,为进一步解析ApoCⅢ引发动脉粥样硬化发生的分子机制提供了理论基础。

富心方通过调控c-Fos-NR4A1-p38通路改善人动脉血管内皮细胞缺氧引起的损伤

目的探讨富心方改善动脉内皮细胞损伤的分子机制。方法将13只雄性SPF级SD大鼠随机分为含药血清组(8只)与普通血清组(5只),通过灌药物、生理盐水分别制备血清。通过预实验采用体外培养的HAECs,分为21%O2常氧培养细胞,2%O2的缺氧培养细胞,两部分细胞都分别给予普通大鼠血清与低、高浓度富心方含药血清(1%,10%);确定RNA高通量测序检测比较21%O2培养对照组(普通血清10%)、2%O2的缺氧模型组(普通血清10%)、2%O2的缺氧模型组加载富心方含药血清(1%和10%)给药组之间的差异基因(DEGs),并从中筛选出本研究的目标基因:既因缺氧发生表达变化,且这些DEG又因富心方作用发生表达变化,同时也是动脉血管内皮细胞损伤相关基因。再结合AmiGO和String数据库筛选推测这些目标基因的相互关系,然后通过ELISA方法和Western blot法验证这些最终筛选出的目标因子在不同细胞模型中的蛋白表达水平和RNA高通量测序基因筛选结果的一致性。结果预实验结果显示,21%O2培养对照组,2%O2的缺氧模型组(两组各加入普通血清1%,10%),不因为不同血清浓度的加入影响细胞的形态和缺氧细胞模型验证因子(eNOS、ACE、ACE2、AGT、IL17、IL18)的表达差异。高通量测序结果显示,缺氧条件下的HAECs中共有7134个基因的表达和正常对照组细胞中的基因表达相比发生了显著变化(上调基因4205个,下调基因2929个),而在富心方作用后的缺氧HAEC中共有762个DEGs(上升305个,下调457个)的变化水平比缺氧模型组细胞中的相同基因变化有显著不同(P<0.05)。最终根据在高通量变化中变化显著,从中选择了与抑制动脉粥样硬化和动脉血管内皮细胞损伤有关的基因,并结合AmiGO和String数据库通过Cytoscape软件构建蛋白质之间相互作用网络确认以下3个基因:原癌基因(c-Fos)、孤儿核受体(NR4A1)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK),既在缺氧条件下相对表达升高,又在富心方加入后相对表达降低,故选择作为本研究的研究靶点基因。ELISA与Western blot结果显示,与21%O2常氧处理的对照组HAEC细胞相比,缺氧模型组c-Fos、NR4A1、p38MAPK的水平在缺氧条件下升高(P<0.05);与缺氧模型组比较,富心方含药血清处理后的细胞HAEC中的c-Fos、NR4A1、p-p38MAPK的蛋白表达水平明显下降,并且是富心方浓度依赖性的(P<0.05)。结论缺氧可导致动脉血管内皮细胞损伤有关的基因的表达水平发生变化,但是富心方含药血清可以浓度依赖性的逆转这些基因的表达,推测富心方通过下调缺氧条件下HEAC细胞中c-Fos基因的表达从而抑制NR4A1基因,并降低由于缺氧升高的p38的磷酸化起到改善动脉血管内皮细胞损伤引起的动脉粥样硬化的作用,该机制还需要进一步通过in vivo和in vitro的实验加以求证。

PKC和血管内皮细胞在15-HETE收缩肺动脉中的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)信号转导途经及血管内皮完整性在15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)收缩肺动脉中的作用。方法采用组织浴槽血管环法与PKC、PKA抑制剂以及除去血管内皮细胞相结合的方法。结果用6·8mmol·L-1hypericin阻断PKC途径可使15-HETE收缩缺氧大鼠肺动脉量效曲线右移(P<0·01);用0·112mmol·L-1KT5720阻断PKA途径使15-HETE收缩缺氧大鼠肺动脉量效曲线右移不明显;除去血管内皮细胞可降低对照组和缺氧组肺动脉血管环对15-HETE的反应性。结论15-HETE收缩肺动脉的作用和PKC信号转导系统以及血管内皮细胞的完整性有关。

ERK1/2通路和血管内皮细胞在15-KETE诱导缺氧大鼠肺动脉收缩中的作用

目的用组织浴槽血管环技术研究细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)通路和血管内皮细胞在15-KETE诱导缺氧大鼠肺动脉收缩中的作用。方法 16只体质量为(220±20)g清洁级Wistar大鼠随机分为2组(n=8),正常对照组置于正常环境中饲养(FiO2=21%),缺氧组置于缺氧的培养箱中饲养(FiO2=10%),连续饲养9 d后处死,游离直径约为0.5—1.0 mm肺内肺动脉(PA)。剪成3 mm长的动脉环,在组织浴槽内进行张力研究。比较在15-KETE给药前后肺动脉环张力变化;机械法去除动脉环内皮,比较内皮完整和去内皮后,15-KETE对缺氧性肺动脉环的收缩作用;用ERK1/2上游激酶抑制剂U0126孵育肺动脉环,比较U0126孵育前后15-KETE对缺氧性肺动脉环的收缩作用;机械法去除动脉环内皮,再比较U0126孵育前后15-KETE对缺氧性肺动脉环的收缩作用。结果 1)15-KETE对缺氧大鼠肺动脉环有收缩作用,呈浓度一效应关系,与正常对照组比较差异显著(P<0.05);2)内皮完整和内皮去除的肺动脉环,15-KETE对其缩血管作用均受到抑制,但差异显著(P<0.05);3)内皮完整肺动脉环,在U0126孵育前后,15-KETE的缩血管作用均受到抑制,但差异显著(P<0.05);4)内皮去除的肺动脉环,U0126孵育前后,15-KETE的缩血管作用也受到抑制,差异显著(P<0.05)。结论 15-KETE可浓度依赖性地收缩缺氧大鼠肺动脉环;15-KETE引起缺氧肺动脉收缩可能与ERK1/2信号转导通路和血管内皮细胞有关,并且位于平滑肌的ERK1/2通路也参与15-KETE诱导缺氧大鼠肺动脉环的收缩。

枸杞多糖在保护力竭运动大鼠胸主动脉血管内皮细胞损伤中的作用研究

目的探讨枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)在力竭运动致大鼠胸主动脉血管内皮细胞损伤中的保护作用。方法雄性SD大鼠40只,按体重随机分为空白对照组,有氧运动组,力竭运动组,力竭运动+LBP组,进行5周游泳训练,建立力竭运动模型。采用离体血管环灌流技术测定大鼠胸主动脉血管环对去甲肾上腺素(NE)诱导的血管反应性;高倍镜下观察HE染色的大鼠胸主动脉血管组织形态的变化;流式细胞术检测外周循环血液中的内皮细胞数;激光共聚焦显微镜检测各组氧化应激(H_2O_2)后细胞内[Ca^(2+)]i浓度变化。结果灌服LBP可以抑制NE诱发的血管收缩反应(P<0.01),减少内皮细胞脱落,降低细胞内Ca^(2+)浓度。结论力竭运动会导致大鼠胸主动脉血管内皮细胞损伤脱落;LBP对大鼠胸主动脉内皮细胞损伤有一定的保护作用。

石菖蒲对尼古丁诱导颈动脉血管内皮细胞凋亡作用机制的研究

目的研究石菖蒲对尼古丁诱导颈动脉血管内皮细胞损伤凋亡中的保护机制。方法雄性大鼠分别给予尼古丁或伴随石菖蒲6周,分离颈动脉血管收集血管内皮细胞,检测不同处理对动脉血管内皮细胞各细胞因子的变化和细胞凋亡情况,并探索其中的机制。结果免疫组化染色结果显示给予尼古丁处理可增加大鼠颈动脉血管内皮细胞VEGF阳性细胞数,同时给予石菖蒲后可降低VEGF的表达。尼古丁处理增加颈动脉血管内皮细胞VEGF、组织因子(TF)的mRNA表达并降低eNOS的表达,给予石菖蒲后逆转这些改变。免疫印迹实验结果显示石菖蒲后可逆转尼古丁处理后引起的颈动脉血管内皮细胞凋亡相关分子Caspase-3、p53、bcl-2的表达上调。石菖蒲可缓尼古丁处理后引起的颈动脉血管内皮细胞线粒体损伤。结论石菖蒲可抑制尼古丁引起的颈动脉血管内皮细胞细胞因子的变化,缓解尼古丁处理后引起的颈动脉血管内皮细胞凋亡,其机制可能与石菖蒲可缓解尼古丁处理后引起的颈动脉血管内皮细胞线粒体损伤有关。

羟基红花黄色素A通过抑制动脉内皮细胞中TNFR1/NF-κB信号通路而发挥抗炎作用

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)对小鼠动脉血管内皮细胞肿瘤坏死因子α受体1/核因子κB(TNFR1/NF-κB)信号通路的作用。方法以(1.2、12、120)μmol/L HSYA预处理体外培养的小鼠动脉血管内皮细胞,之后以肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导细胞,采用Western blot法检测HSYA对TNFR1介导NF-κB信号通路相关蛋白核因子κB抑制蛋白α(IκBα)表达的影响;采用实时定量PCR检测HSYA对TNF-α诱导的NF-κB下游分子细胞间黏附分子1(ICAM-1)和E选择素(E-selectin)mRNA表达的抑制作用;采用流式细胞术检测细胞膜TNFR1表达量的变化;利用TNF-α转化酶(TACE)抑制剂TAPI-0检测TACE是否参与HSYA对TNFR1介导信号的抑制作用。结果 HSYA可呈剂量依赖性抑制TNFR1介导的NF-κB上游分子IκBα蛋白降解;HSYA可显著抑制NF-κB下游分子ICAM-1和E-selectin的mRNA表达;HSYA可显著减少细胞膜TNFR1蛋白含量;TAPI-0可抑制HSYA对TNFR1信号的调控作用。结论 HSYA可抑制血管内皮细胞中TNFR1/NF-κB信号通路而发挥抗炎作用,TACE参与介导HSYA的抗炎作用。

冠状动脉微血管内皮细胞释放的神经调节蛋白-1对缺血/再灌注心肌的作用及其机制探讨

目的探讨大鼠缺血/再灌注损伤(I/RI)时,神经调节蛋白-1(NRG-1)在冠状动脉微血管内皮细胞(CMECs)-心肌细胞共培养中的作用及其机制。方法分离培养大鼠CMECs和心肌细胞,建立CMECs-心肌细胞共培养(Coculture)模型和体外模拟缺血/再灌注(SI/R)模型,收集CMECs培养上清。MTT法检测心肌细胞活性,TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,Western blot法检测CMECs培养上清中NRG-1表达、心肌细胞p Erb B2、p ERK基因和环氧化酶-2(COX-2)水平,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)酶活性反应心肌细胞凋亡。结果在心肌细胞中,与对照组相比,SI/R(4 h/4 h)组细胞活性明显降低(P<0.01),SI/R+Coculture组细胞活性升高(P=0.02)。CMECs在SI/R 4 h/4 h时,NRG-1的分泌较对照组增加最明显(P<0.01)。心肌细胞SI/R组凋亡指数和Caspase-3酶活性比对照组明显升高(27.97±0.90比3.58±0.23,P<0.01;375.93±11.76比100.00±0.00,P<0.01)。共培养或NRG-1处理细胞后,凋亡指数和Caspase-3酶活性较SI/R组降低(16.82±1.03比27.97±0.90,P<0.01;166.16±15.15比375.93±11.76,P<0.01),且Erb B2和ERK磷酸化水平以及COX-2表达明显增加(均为P<0.01)。用Erb B2或ERK1/2抑制剂预处理心肌细胞后,共培养和NRG-1的作用消失(均为P<0.01)。结论在I/RI过程中,CMECs释放NRG-1,抑制I/RI诱导的心肌细胞凋亡,其保护作用与增加Erb B2、ERK磷酸化和COX-2表达可能有关。

单壁纳米碳管对大鼠主动脉内皮细胞损伤作用的研究

为了探索单壁纳米碳管(SWCNT)能否引起血管内皮细胞损伤及其可能的损伤机制,将大鼠主动脉血管内皮细胞暴露于不同浓度的SWCNT水溶液中(0.8、1.6、3.12、6.25、12.5、25、50、100、200μg·mL-1)中染毒,染毒不同时间后测定细胞存活率、细胞内LDH和GSH含量并进行综合分析.结果表明,随着SWCNT染毒浓度和染毒时间的上升,大鼠主动脉血管内皮细胞存活率逐渐下降,死亡率逐渐上升;细胞内LDH在SWCNT染毒浓度为0￣100μg·mL-1范围内其释放随染毒剂量的增加而逐渐上升,在200μg·mL-1剂量组,其释放有所减弱;而细胞内GSH在SWCNT染毒浓度为0￣200μg·mL-1范围内其含量随染毒剂量的增加而逐渐下降.以上结果说明,SWCNT可致血管内皮细胞损伤,其机制可能为氧化损伤途径.

低氧大鼠肺动脉内皮细胞VEGF变化与PKC活性关系的探讨

目的 :探讨低氧培养大鼠肺动脉血管内皮细胞VEGF的表达变化与PKC活性的关系。方法 :培养大鼠肺动脉血管内皮细胞 ,观察低氧 (1%O2 )培养不同时间大鼠肺动脉血管内皮细胞浆、膜PKC活性和培养液中VEGF水平变化 ;加入PKC抑制剂 (staurosporine)后 ,测定低氧、常氧培养不同时间二者的变化。结果 :低氧时膜PKC活性和培养液中VEGF水平明显升高 (P <0 .0 1)。而加入PKC抑制剂后 ,常氧和低氧培养的内皮细胞浆、膜PKC活性都明显下降 (P <0 .0 1) ,相应的培养液中VEGF水平与常氧对照组比较无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论 :低氧时PKC活性升高与VEGF表达升高有密切关系 ,PKC对低氧时VEGF的表达起正调控作用。

左旋芳樟醇和β-石竹烯对鸡血管内皮细胞炎性损伤的影响

目的探讨左旋芳樟醇((-)-Linalool)和β-石竹烯(BCP)对鸡血管内皮细胞(chPAEC)炎性损伤的影响。方法实验分为空白对照组,脂多糖(LPS)组以及药物低、中、高剂量组,除空白对照组外其余组分别给予LPS和LPS+药物共孵育12 h之后,采用ELISA法检测(-)-Linalool和BCP对炎性因子iNOS、PGE2、COX-2和黏附因子VCAM-1、ICAM-1的影响;通过qRT-PCR法检测IL-6、TNF-α、CD14、TLR4和MyD88 mRNA的表达;利用Western-blot法来检测细胞内NF-κBp65蛋白的表达。结果 (-)-Linalool和BCP能显著降低LPS诱导chPAEC的iNOS、PGE2、COX-2、VCAM-1、ICAM-1的分泌(P<0.05,P<0.01),且使iNOS、PGE2、VCAM-1的分泌呈剂量依赖性;也能显著降低IL-6、TNF-α、CD14、TLR4和MyD88 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖性;也能显著下调细胞中NF-κBp65蛋白的表达(P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖性。结论 (-)-Linalool和BCP可通过抑制NF-κB信号通路的活化来减少黏附因子和炎性因子分泌,从而缓解LPS引起的血管内皮细胞炎症损伤,相对而言,(-)-Linalool在抑制血管内皮细胞炎症方面的作用效应稍佳。

积雪草苷调控基质金属蛋白酶-9减轻川崎病血管损伤的机制研究

目的探讨积雪草苷对川崎病血管损伤的影响及其可能作用机制。方法采用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人冠状动脉血管内皮细胞建立川崎病血管损伤模型,分为7组:con组、TNF-α组、TNF-α+低积雪草苷组、TNF-α+中积雪草苷组、TNF-α+高积雪草苷组、TNF-α+积雪草苷+pcDNA组、TNF-α+积雪草苷+pcDNA-MMP-9组;CCK-8法、流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;qRT-PCR检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA的表达水平;ELISA法检测IL-6、IL-1的水平;Western blot法检测Bax、Bcl-2、MMP-9蛋白表达量。结果与con组比较,TNF-α组细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高,IL-6、IL-1的水平升高,MMP-9 mRNA及蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与TNF-α组比较,TNF-α+低积雪草苷组、TNF-α+中积雪草苷组、TNF-α+高积雪草苷组细胞凋亡率和Bax蛋白水平降低,IL-6、IL-1的水平降低,MMP-9 mRNA及蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且呈剂量依赖性;与TNF-α+积雪草苷+pcDNA组比较,TNF-α+积雪草苷+pcDNA-MMP-9组MMP-9 mRNA及蛋白水平升高,细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高,IL-6、IL-1的水平升高,Bcl-2蛋白水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论积雪草苷可通过下调MMP-9表达而抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞凋亡及炎症反应从而减轻川崎病血管损伤。

过氧化还原蛋白酶2对颈动脉粥样硬化血管内皮细胞增殖和凋亡及迁移的影响

目的探讨过氧化还原蛋白酶2(peroxlredoxin 2,Prdx2)对颈动脉粥样硬化血管内皮细胞HCVSMCs增殖、凋亡与迁移的影响。方法对数生长期人颈动脉粥样硬化血管内皮细胞HCVSMCs随机分为空白组(不进行转染)、对照组(转染pcDNA3.0载体)和观察组(转染pcDNA3.0-Prdx2载体)。取转染24、48h细胞,采用MTT法检测细胞增殖,双染法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot法检测Prdx2、Myc蛋白相对表达量,Transwell小室实验检测细胞迁移能力。结果转染24、48h后培养24h,观察组细胞增殖指数[(66.77±8.22)%、(78.40±9.48)%]高于对照组[(35.68±7.11)%、(46.83±10.03)%]、空白组[(35.28±8.14)%、(49.02±8.11)%](P<0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。转染24、48h,观察组细胞凋亡指数[(5.66±0.20)%、(6.18±0.33)%]低于对照组[(15.76±0.55)%、(17.02±0.51)%]、空白组[(15.09±0.28)%、(17.03±0.77)%](P<0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。转染48h,观察组G0/G1期细胞比率[(59.52±4.63)%]高于对照组[(41.15±6.61)%]、空白组[(41.02±5.62)%](P<0.05),S期和G2/M期细胞比率[(13.97±2.56)%、(26.19±2.66)%]低于对照组[(25.05±4.87)%、(35.92±4.52)%]、空白组[(25.75±3.11)%、(35.44±4.55)%](P<0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。转染24、48h,观察组Prdx2蛋白相对表达量(7.92±0.40、8.45±0.08)、Myc蛋白相对表达量(4.55±0.09、4.58±0.16)高于对照组(Prdx2:1.82±0.67、1.91±0.02;Myc:1.14±0.08、1.51±0.09)和空白组(Prdx2:1.85±0.61、2.04±0.41;Myc:1.16±0.10、1.53±0.10)(P<0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。转染24、48h,观察组细胞迁移距离[(91.22±5.11)、(98.04±6.34)μm]较对照组[(45.45±6.23)、(54.11±7.22)μm]、空白组[(45.61±4.09)、(55.72±5.11)μm]远(P<0.05),对照组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论Prdx2高表达能促进颈动脉粥样硬化血管内皮细胞HCVSMCs增殖与迁移,抑制其凋亡,调节细胞周期,促进Myc蛋白表达,抑制动脉粥样硬化进展。

枸杞多糖通过抗氧化及抗凋亡作用对过氧化氢致血管内皮细胞损伤的保护作用研究

目的探讨枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)对氧化应激致大鼠主动脉血管内皮细胞(Rat Artery Endothelial Cells,RAEC)损伤的抗氧化及抗凋亡的保护作用,为进一步开发LBP的药用价值提供实验及理论依据。方法培养RAEC并随机分为3组:对照组、过氧化氢损伤组(H2O2组)、H2O2+LBP (440μg/ml)组,采用比色法检测培养细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)及NO(一氧化氮)水平;Western blot法检测细胞Bcl-2及Bax的表达水平。结果与对照组比较,H2O2组SOD活力与NO含量明显降低(P<0.05)、MDA含量明显升高(P<0.05);与H2O2组比较,H2O2+LBP组SOD活力及NO含量升高(P<0.05)、MDA含量降低(P<0.05)。与正常对照组比较,H2O2组Bcl-2表达下降,Bax表达升高,Bcl-2/Bax下降(P<0.05);与H2O2组比较,H2O2+LBP组Bcl-2蛋白的表达升高、 Bax表达下降及Bcl-2/Bax升高(P<0.05)。结论枸杞多糖可通过抗氧化和抗凋亡作用发挥对过氧化氢致主动脉血管内皮细胞损伤的保护作用。