脲对Flt3配体包涵体蛋白质体外复性与同时纯化的作用研究

目的研究小分子脲对包涵体蛋白质体外复性与同时纯化的作用。方法考察在高效疏水相互作用色谱(HPHIC)流动相中添加脲时,不同浓度的小分子脲对包涵体蛋白重组人酪氨酸激酶配体(recombined human Flt3ligand,rhFL)复性效率的影响,并采用荧光光谱技术,进一步研究目标蛋白Flt3复性前后复性效果变化与荧光强度变化的规律。结果当脲的添加浓度为3mol·L^(-1)时,rhFL的质量回收率达到33.1%,更易于恢复其天然构象及生物活性。结论添加适当浓度的脲可促进rhFL的复性与同时纯化,通过荧光光谱技术可以初步推测包涵体蛋白在复性过程中生物活性的变化,为rhFL蛋白药物的研发提供参考。

包涵体蛋白质的品质

包涵体(inclusion body,IB)曾被认为缺乏正确的分子结构。近年来,傅里叶变换红外光谱(FT-IR)成为对包涵体蛋白质进行结构分析的有效手段,利用傅里叶变换红外光谱对包涵体蛋白质进行结构分析,表明IB蛋白质含有天然或类天然结构。所谓的包涵体蛋白质的品质,是指与复性率相关的IB蛋白质状态,主要反映为包涵体蛋白质构象的差异性。影响包涵体蛋白质品质的,既有内因也有外因,分析其影响因素,将有助于调整重组蛋白质生产的最佳培养条件。活性包涵体是近年来包涵体研究领域最具意义的成就之一。对包涵体蛋白质品质的研究将对包涵体蛋白质的复性以及活性包涵体的研究和应用具有重要意义。

委内瑞拉马脑炎病毒重组抗原的制备纯化及其胶体金免疫层析检测方法的建立

目的:表达委内瑞拉马脑炎病毒E2重组蛋白,并结合胶体金免疫层析技术建立一种简便检测委内瑞拉马脑炎病毒特异性抗体的方法。方法:利用已经构建的表达E2抗原的工程菌,用IPTG诱导,表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过一系列条件的变性、复性、透析,所制抗原用以包被硝酸纤维素膜,利用胶体金标记和免疫层析技术,建立委内瑞拉马脑炎病毒快速检测方法。对该方法的敏感性、特异性和稳定性作出评价。结果:重组工程菌可表达分子质量为40 kDa的目的蛋白,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE显示纯度达95%以上。建立的检测方法可在20 min内完成检测。对症状相似及近缘的其他病毒进行检测,均无非特异反应。试纸条在37℃下保存2周,检测结果不变。该方法与R&D公司商品化的ELISA试剂盒灵敏度检测无明显差异;对92份阴性血清进行检测,两种检测方法的符合率为96.7%。结论:重组委内瑞拉马脑炎病毒蛋白产生的包涵体变性复性后生具有良好的重复性和稳定性,可作为委内瑞拉马脑炎病毒多种检测方法的抗原原料。胶体金免疫层析法具有快速、灵敏、特异、稳定的特点,适用于现场检测。