同时检测贝类派琴虫和包纳米虫的双重LAMP方法的建立

为满足贝类寄生虫快速检测需求,本研究根据GenBank中发布的派琴虫ITS序列和包纳米虫18SrRNA序列的保守区域分别设计LAMP扩增引物,分别建立了两种寄生虫的单重LAMP检测方法,进一步对反应体系进行优化,组装成两种寄生虫的双重LAMP方法,同时还进行了特异性检测和敏感性检测,并通过对扩增产物进行限制性内切酶酶切检验双重LAMP方法的准确性。结果表明本研究建立的贝类寄生虫双重LAMP方法具有较好的特异性,检测派琴虫时的最低检测限为10拷贝/μL质粒DNA,检测包纳米虫时的最低检测限为100拷贝/μL质粒DNA,同时酶切试验也验证了双重LAMP检测结果的准确性。对随机采自东海和黄海的20份菲律宾蛤仔和10份美国进口牡蛎的检测结果显示,该双重LAMP方法在口岸检疫工作中可以作为派琴虫和包纳米虫的快速检测方法。

贝类包纳米虫病焦磷酸测序检测方法的建立与应用

以焦磷酸测序技术为检测平台,在研究包纳米虫基因特性的基础上,选择包纳米虫(Bonamiaspp.)DNA序列的保守区域,利用焦磷酸测序软件设计专用引物。以OIE推荐的PCR方法构建的阳性质粒作为模板,建立了包纳米虫的PCR-焦磷酸测序检测方法,确定测得序列为包纳米虫序列,经酶切位点分析可鉴别感染种类。以建立的包纳米虫PCR-焦磷酸测序方法对进口牡蛎(Ostrea gigas thunberg)样品进行检测,同时以OIE推荐的PCR-RFLP方法进行对照检测,检测结果表明,本研究建立的PCR-焦磷酸测序检测方法可以在基因序列水平上准确鉴定样品是否为包纳米虫感染以及感染种类,检测结果与OIE推荐方法的检测结果一致。研究结果表明,本研究建立的检测方法可应用于口岸包纳米虫感染情况的检测鉴定。

同时检测海洋贝类包纳米虫和派琴虫的双重TaqMan MGB探针实时荧光PCR方法

根据包纳米虫(Bonamia sp.)SSU rDNA和派琴虫(Perkinsus sp.)ITS rDNA的保守区序列,设计特异性引物和Taqman MGB探针,建立了同时检测上述两种贝类原虫的双重实时荧光PCR方法.该方法可检测到包纳米虫基因的446拷贝质粒,以及派琴虫基因的171拷贝质粒,具有较高的灵敏度.以10倍系列稀释的包纳米虫阳性标准品质粒和派琴虫阳性标准品质粒为模板,测得该方法的定量标准曲线相关系数分别为0.999和1.000,显示出很好的扩增效率.同时该方法与尼氏单孢子虫(Haplosporidium nelsoni)、沿岸单孢子虫(H.costale)等其他贝类原虫,以及副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和鮰爱德华氏菌(E.ictaluri)等海水养殖常见致病菌之间无交叉反应,表现出较高的特异性.福建莆田的湄州湾、平海湾、兴化湾等地采集的296份贝类临床样本的检测证明,该方法是一种有效的快速检测鉴定上述2种贝类原虫的方法,具有良好的灵敏度和特异性,可广泛应用于海洋贝类原虫感染情况调查,以及贝类疫病检疫监控等领域.

牡蛎包纳米虫体外培养及鉴定

近几十年来,牡蛎包纳米虫病在欧洲等地频发,引起牡蛎大范围的死亡,对牡蛎养殖业危害极大。目前包纳米虫的研究处于初级阶段,病原的体外培养技术是深入研究包纳米虫的致病机理、与宿主的相互作用及疫病防控的基础。本研究以经PCR初步鉴定阳性的牡蛎全组织作为培养基,体外培养1个月后,采用原位杂交方法再次鉴定牡蛎包纳米虫。2次鉴定结果一致,且在包纳米虫培养1个月之后,虫体均能被原位杂交方法检测到。研究结果表明,本研究成功建立了一种简单可行的牡蛎包纳米虫培养方法。

潜在外来入侵动物疫病——包纳米虫病

随着国内养殖业的迅猛发展,进口的水生动物种苗数量不断增加。人们生活和消费水平的提高,促进了贝类等水生动物及其产品进出境数量与批次逐年增多,外来动物疫病传入我国的风险与日俱增[1]。外来入侵动物疫病能对我国经济和农牧渔业造成巨大的影响,主要包括：1）严重威胁我国畜牧业生产及公共卫生安全;2）对外来入侵动物疫病的根除和防治非常困难,投入巨大,收效甚微;