苏南地区1b型丙型肝炎病毒包膜区变异进化研究

本研究旨在了解本地区丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)基因型构成的前提下,分析1b型丙型肝炎病毒包膜2(second envelope glycoprotein E2)区的变异和种系进化,并研究其准种变异与临床肝病活动度的关系。对宜兴市人民医院收集的抗HCV抗体阳性患者166名,RT-PCR方法检测HCVRNA,HCVRNA阳性患者采用型特异性引物分型法确定病毒基因型;选择其中未经干扰素治疗的43例1b型慢性丙型肝炎患者的血清标本,扩增E2区,从中选取肝硬化患者4例,慢性非肝硬化患者6例的E2区PCR产物纯化测序,序列采用CLUSTALW与GENBANK上多株不同型别的HCV序列进行比对分析,结果采用Phylip软件构建遗传进化树;并观察E2区高变区1(HVR-1)的氨基酸(aminoacid,aa)残基序列的变异特征;采用单链构象多态性垂直电泳检测43例患者个体内HCVE2区准种的变异情况,比较不同肝病活动度患者准种变异情况。结果表明本地区HCV以1b型为主(84.3%),对E2区基因序列和氨基酸序列变异的分析显示其变异具有一定的规律性,种系进化树提示本地区HCV病毒序列与上海、湖南、日本等地的HCV株有较近的亲缘性。43例患者中ALT高于正常的丙型肝炎患者准种复杂程度明显高于ALT正常者(P<0.05)。故本地区HCV基因变异符合中国东南部的特点,基因变异与临床肝病活动度具有相关性。

献血者体内携带的HCV包膜区基因同源性分析

目的 建立 HCV包膜区基因同源性分析方法 ,探讨献血者体内携带的 HCV包膜区基因变异情况。 方法 通过 RT-PCR和序列测定 ,对 9例献血者体内携带的 HCV基因组中高变的包膜区 (E1和 E2 / NS1区 )基因变异进行了横断面的同源性分析。 结果 不同型 HCV毒株间的同源性只有 5 6.99%～ 68.80 % ;同一亚型内毒株间的同源性为80 .3 3 %～ 96.40 % ,且有地区性分布的特点。 结论 在无症状的 HCV携带献血者中 ,不同 HCV毒株间高变区基因的变异相当大 ,以此可在分子水平上对丙型肝炎的传播途径进行确认 ,对供受者间输血后丙型肝炎的因果关系进行鉴定。

中国地区HCV株包膜区cDNA序列变异性分析

目的 研究国内不同地区ＨＣＶ包膜基因区变异。方法 对国内不同地区慢性丙型肝炎患者的１３株 ＨＣＶ采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增ＨＣＶ包膜基因区（Ｅ１、 Ｅ２／ＮＳ１）片段，对其中的１００５ｂｐ的ｃＤＮＡ进行测序，并与 国内外株进行变异性分析。结果 国内ＨＣＶ株比较，同型（Ⅱ）间该区核苷酸和氨基酸的同源性分别介于７６．４２％～ ９７．１１％和７５．２２％～９３．１５％，不同型（Ⅲ）间分别为６２．２９％～６３．３８％和５１，２９％～６０．００％；国内与国际同型株比较，同型 （Ⅱ）间分别为７３．７３％～８７．７６％和７５．８２％～８８．０９５％，不同型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）间分别为６１．４９％～８１．４９％和４９．３５％～７８．２１％；国 内外１８株ＨＣＶ的ＨＶＲ１区同源性仅为３６．１１％～７５、３１％和２０．８０％～６２．９６％，发现两个新的较高变异区（第２５０～２５７ 位和第４４３～４６５位氨基酸）。结论 ＨＣＶ包膜区序列分析同型间同源性较高，异型间同源性较低；南北地区有差 异，国内外差异更大；最大的变异在ＨＶＲ１，并发现两个新的较高变异区。

丙型肝炎病毒包膜区变异与感染慢性化关系的初步研究

目的 探讨丙型肝炎病毒 (HCV)包膜区变异与其感染慢性化的关系。方法 3份HCV慢性感染者和 3份急性感染者血标本 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增HCV的E1区C端及E2区N端片段 (5 73bp) ,扩增产物进行克隆 ,以单链构象多态性 (SSCP)和异质性双体 (HD)分析对每份血清 30个克隆的E1 E2区准种 (quasispecies)进行筛选 ,挑选每份标本HCV的优势株与劣势株序列进行测定 ,分析非同义替换碱基数与同义替换碱基数比率 (dN dS ,间接反映选择压力 )和推导的氨基酸序列。结果 HCV慢性感染者病毒准种的复杂性和E2区dN dS明显高于急性感染者。HCV慢性感染者的E2区氨基酸替换率 (8.4 6 % )比急性感染者 (1.0 2 % )更高 ,而两者的E1区氨基酸替换率(分别为 2 .74 %和 1.0 9% )均较低。尽管HVR1变异程度更高 ,但仍存在高度保守的氨基酸位点。结论 HCV持续性感染与准种复杂性增高和宿主对HVR1的免疫选择有关。

上海地区Ⅱ、Ⅲ型丙型肝炎病毒包膜区cDNA序列分析

目的 分析上海地区丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus ,HCV)Ⅱ、Ⅲ型包膜区cDNA序列变异。方法 采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增HCV包膜区E1、E2 /NS1片断 (10 0 5bp) ,在373DNA全自动测序仪上进行了序列分析。结果 HCV E1、E2 /NS1区核苷酸和氨基酸同源性比较显示 :上海株Ⅱ型、Ⅲ型间同源性分别为 6 2 .48%和 5 9.10 % ;上海株与国内外同型株间分别为85 .97%～ 87.36 %和 83.38%～ 86 .5 7% ;上海株与国内外不同型株间分别为 6 1.49%～ 70 .95 %和5 9 .10 %～ 78.2 1%。此外 ,共发现 5个变异较大的区域 ,其中两个是国际公认的高变区 (HVR1及HVR2 ) ,另外 3个为首次报道 (第 2 5 1～ 2 5 8、2 97～ 30 1、46 1～ 46 7位氨基酸 )。结论 HCV E1、E2 /NS1序列变异大 。

合并感染HIV对1b型HCV E2/NS1包膜区基因影响

目的研究人类免疫缺陷病毒(HIV)感染对1 b型丙型肝炎病毒(HCV)E2/NS1包膜区基因变异的影响,探讨2组间E2/NS1区基因序列同源性差异,为HCV/HIV合并感染者中HCV的治疗提供依据。方法对河南省某有偿献血村进行随访,将得到的所有HCV阳性病例255例根据合并HIV感染的情况分成2组,并对其基因分型,然后进行逆转录(RT)-巢式PCR扩增1 b型HCV E2/NS1包膜区基因,继而进行单链构象多态性分析(SSCP)、纯化后测序。结果 HCV单纯感染组和HIV/HCV合并感染组SSCP平均条带数分别为(3.4±0.55)、(2.6±0.55)条,差异有统计学意义(t=2.32,P=0.049);HCV单纯感染组和HIV/HCV合并感染组HCV E2/NS1包膜区同源性分别为76.7%和87.6%,差异有统计学意义(χ2=20.13,P<0.001);2组第一高变区(HVR-1)同源性分别为59.3%和81.9%,差异有统计学意义(χ2=10.39,P=0.001);2组第3高变区(HVR-3)同源性分别为71.7%和83.9%,差异有统计学意义(χ2=4.60,P=0.03);单纯HCV组中变异性较高的氨基酸位点在HCV/HIV合并感染组中表现出较高的保守性。结论 HIV感染对1b型HCV E2/NS1包膜区基因变异具有抑制作用,且其主要体现在HVR-1和HVR-3区。

乙型脑炎病毒膜蛋白B区多肽抗原的表达、纯化及血清学评价

目的在原核表达系统中对乙型脑炎病毒包膜糖蛋白(E蛋白)的B区多肽抗原进行高效表达、纯化及血清学评价。方法利用PCR技术从乙脑减毒活疫苗中扩增编码B区的DNA片段,酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3)并表达B区多肽抗原,表达产物经液相层析纯化;用乙脑病人血清对纯化后的B区多肽抗原进行评价。结果重组质粒pET22b-JEB经双酶切,其插入的外源基因片段为372 bp,与预期DNA片段大小一致。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS-PAGE电泳,均可见一条约16kD的外源基因蛋白带,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA血清学评价,表明重组B区多肽抗原具有较高的灵敏性及特异性。结论成功构建了表达载体pET22b-JEB,在原核系统中表达的B区多肽抗原具有良好的血清学检测价值。

慢性肝炎患者血清中丙型肝炎病毒核心区和包膜1区基因变异研究

目的探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）区和包膜１（Ｅ１）区变异与其感染慢性化的关系。方法１０例ＨＣＶ慢性感染者和２例急性感染者血标本，采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增ＨＣＶ的Ｃ区羧基端、 Ｅ１及 Ｅ２区氨基端片断（１ｋｂ），扩增产物进行克隆，以单链构象多态性（ＳＳＣＰ）和异质性双体（ＨＤ）分析对每份血清的３０个克隆的Ｃ／Ｅ１区准种（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）进行筛选，挑选每例标本ＨＣＶ的优势株与劣势株序列进行测定，并分析推导的氨基酸序列。结果各例患者血清中ＨＣＶ的Ｃ／Ｅ１区扩增片段形成的ＳＳＣＰ条带间差异明显，而ＨＤ与同源双体之间差距不明显。ＨＣＶ急性感染者和慢性感染者血清病毒Ｃ区无发生变异，后者Ｅ１区氨基酸替换率为１．３２％，但功能性氨基酸无改变。结论ＨＣＶ的Ｅ１区序列变异以准种形式存在，但与免疫逃避可能无关。

丙型肝炎病毒细胞和动物模型研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）为黄病毒科病毒的一条RNA正链.整条负链的中间编码区域、包膜、非结构蛋白都可以进行复制,包膜区包括超变量区域,与序列的变异有关.丙型肝炎“基因准种”的出现对疫苗和包括针对逃避变异抗病毒药物的开发增加了难度.……